外源磷脂酰乙醇胺诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

　　　　 作者：王爱英，胡晓岩，李宗芳，刘利英，倪磊，于林，宋土生

【摘要】 目的 磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine， PE)在细胞凋亡的早期由细胞膜内侧翻转到外侧，与磷脂酰丝氨酸共同成为细胞凋亡的早期信号，但是其在凋亡中的作用尚不清楚。本研究探讨了PE对HeLa细胞凋亡的影响。方法 实验以人宫颈癌HeLa细胞系为材料，分别设置了空白对照组、0.125、0.25、0.5和1mmol/L PE处理组。以MTT检测细胞生长情况，PI流式细胞仪法检测细胞周期，Annexin VPI法检测细胞凋亡。结果 与对照组相比，PE各处理组对HeLa细胞生长的抑制作用呈剂量与时间依赖性，并诱导细胞凋亡发生，但不影响细胞周期。结论 PE通过诱导细胞凋亡而抑制HeLa细胞的生长。

【关键词】 磷脂酰乙醇胺；细胞凋亡；HeLa细胞

　　ABSTRACT: Objective Phosphatidylethanolamine (PE) is an important phospholipid component in the cell membrane and is involved in the formation of membrane asymmetry. PE is exposed on the cell surface with phosphatidylserine during apoptosis. However， the effects of PE on cell apoptosis are not clear. In this study， we investigated effects of PE on apoptosis in human cervical cancer HeLa cells. Methods HeLa cells were used as the experiment material， and were pided into five groups: blank control group， and four treatment groups of 0.125， 0.25， 0.5 and 1 mmol/L PE， respectively. The cell growth was tested by MTT assay; the cell cycle and apoptosis were analyzed using flow cytometry. Results Compared with the control group， PE inhibited the growth of HeLa cells in all the treatment groups in dose and timedependent manners， and induced the apoptosis， but did not change the cell cycle. Conclusion PE inhibits the growth of HeLa cells by inducing the apoptosis.

　　KEY WORDS: phosphatidylethanolamine; apoptosis; HeLa cell

　　细胞膜的磷脂成分包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine， PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine， PE)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine， PS)和鞘磷脂(sphingomyelin， SM)[1]。在细胞膜上，磷脂呈不均等对称分布，PC和SM分布于细胞膜的外侧，而PE和PS分布于内侧[23]。氨基磷脂转位酶(aminophospholipid translocase)参与了PE和PS的膜不对称分布[4]。在正常情况下，氨基磷脂转位酶可以将细胞膜外侧的PE和PS转为内侧。抑制氨基磷脂转位酶活性可以诱导CNS衍化HN25和HOG细胞凋亡，并引起caspase3激活[5]，提示细胞膜磷脂分布异常可以引起细胞凋亡发生。细胞膜PS外翻已经成为细胞凋亡的重要检测指标，并有研究证明PS外翻参与了细胞凋亡的诱导过程[67]。在细胞凋亡过程中，PE也发生外翻作用，并与PS一起参与了凋亡细胞脂筏的形成[8]。近年研究发现细胞内PE结合蛋白(Raf kinase inhibitor protein， RKIP)表达增高，可以抑制RafERK1/2通路[9]。但是，关于PE是否能引起细胞增殖或凋亡尚不清晰，本研究组研究发现外源PE可以诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡发生，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及材料

　　RPMI 1640培养液和FBS胎牛血清购自GIBCO公司；PE和PI购自Sigma公司；Annexin VFITC apoptosis detection kit购自BD Bioscience公司。

　　1.2 细胞培养

　　人宫颈癌HeLa细胞株为西安交通大学生物医学研究实验中心提供，培养于含100mL/L FBS的RPMI 1640培养基中，于含50mL/L CO2、饱和湿度和37℃条件下培养，细胞浓度为5×104/mL。
1.3 实验分组 实验分为对照组和处理组。处理组分为0.125、0.25、0.5和1mmol/L PE 4组。细胞在正常培养基中培养24h后，用含有不同浓度PE的培养基更换并继续培养到测试时间。

　　1.4 细胞增殖检测

　　用MTT法测定。选用对数生长期的HeLa细胞，以5×104/mL的细胞密度接种于96孔平底细胞培养板中，每孔总液量200μL。接种第2天换处理培养基，继续培养到测试时间前4h，每孔加入MTT液20μL，37℃、50mL/L CO2下继续孵育至测试时间，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，振荡5min，在高通量多功能微板测试系统波长490nm下测定每孔光的吸光度值(A490)。

　　1.5 细胞周期分析

　　选用对数生长期的HeLa细胞，以5×104/mL的细胞密度接种于24孔平底细胞培养板中，每孔总液量1mL。处理同前，消化、固定并收集细胞，每孔细胞加PI(100mg/L)染液100μL，避光，37℃孵育30min，上流式细胞仪检测。结果用随机软件分析。

　　1.6 细胞凋亡检测

　　使用AnnexinPI法。消化后，细胞用冷PBS洗2次，调整浓度到1×105/mL。取100μL细胞，并加入5μL FITCAnnexin V及5μL PI(浓度250mg/L)，混匀后置于冰浴上闭光孵育10min，在BD公司流式细胞仪检测，光源为488nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光，结果用随机软件分析。

　　1.7 统计分析

　　用SPSS11.0软件分析，实验数据以±s表示，采用t检验。

　　2 实验结果

　　2.1 PE抑制HeLa细胞生长

　　PE作为细胞膜的重要成分，具有维持细胞膜稳定性的作用。外源PE可以显著地抑制HeLa细胞生长，并呈时间和剂量依赖性。对照组HeLa细胞呈三角形或多角形，细胞轮廓清晰，立体感较强。PE处理48h后，细胞发生变形，立体感降低，细胞轮廓趋于模糊；在高浓度时，圆形细胞增多(图1A)。在PE处理72h时，0.5和1mmol/L浓度各组细胞生长抑制持平(图1B)。各处理组与对照组之间均存在显著性差异(P<0.01)。

　　2.2 PE不影响HeLa 细胞的细胞周期

　　细胞生长抑制受细胞增殖周期阻滞和细胞凋亡的影响。在PE抑制细胞生长的过程中，未观察到细胞增殖周期的阻滞。PE处理组在G1/G0、S和G2/M的细胞分布与对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)，表明PE不影响细胞增殖周期(图2)。

　　2.3 PE诱导了HeLa细胞的凋亡

　　应用AnnexinPI法测定了PE处理24h的HeLa细胞凋亡情况。结果显示，0.125mmol/L PE已具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，随着PE浓度的增加，细胞凋亡随之升高。0.5mmol/L和1mmol/L PE分别在早期凋亡和晚期凋亡达到高峰(图3)。

　　3 讨论
　　
　　磷脂酰乙醇胺是维持细胞膜不对称性的重要磷脂成分。在正常细胞膜上，PE分布于细胞膜的内侧，而在细胞凋亡的过程中，其与PS一起外翻到细胞膜外侧[10]。目前，大量研究认为PS外翻是细胞早期凋亡的信号，并参与细胞凋亡的发生。关于PE在细胞凋亡过程中的作用尚不清晰。本研究首次研究证明，外源PE可以显著抑制Hela细胞的增殖，并发现PE对SMMC7721、HEK293以及HepG2具有相同的作用，表明PE细胞增殖抑制作用没有细胞特异性(数据未显)。

　　细胞增殖抑制受细胞增殖周期和细胞凋亡的双重影响。细胞增殖检测显示PE在不同浓度下均不引起Hela细胞周期的改变，提示PE未通过细胞周期调控Hela细胞的生长抑制。凋亡检测结果证明，PE明显诱导了Hela细胞凋亡的发生。细胞凋亡指标与细胞生长抑制的结果一致。实验表明，细胞凋亡是PE抑制细胞生长的主要方式。

　　PE是细胞膜不对称分布的磷脂成分，在培养细胞时，提供外源PE，可能会引起细胞膜稳定性下降，并诱导细胞凋亡。我们对HepG2进行研究时发现，PE处理细胞后，线粒体Δψm下降的细胞比例明显增加，引起Bcl2表达下调以及Bax上调，以及caspase3的激活。体外实验证明，酸性磷脂和中性磷脂组成的脂质体进行细胞色素c跨膜运送时，PE具有关键的作用。在PA∶PE∶PC体系中随着PE 含量的增加， 细胞色素c跨膜运送增加[11]。关于PE是否通过线粒体通路诱导细胞凋亡，有待进一步的研究。

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