低温等离子体对白色念珠菌影响的电镜观察

　　　　作者：石兴民，张冠军，袁育康，马跃，许桂敏，顾宁

【摘要】 目的 研究低温等离子体对白色念珠菌结构的影响，探讨低温等离子体对白色念珠菌的灭活机制。方法 选择白色念珠菌ATCC10231作为实验菌株，以介质阻挡放电方法产生的低温等离子体对其进行处理，使用扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)分别观察白色念珠菌细胞表面和细胞内部的变化情况。结果 低温等离子体处理30s后，SEM观察显示一些白色念珠菌细胞表面明显出现缺损，而TEM观察显示一些白色念珠菌细胞的细胞壁及细胞膜断裂，核心溶解，菌体近似空壳。结论 低温等离子体可破坏白色念珠菌表面和内部结构，这可能是低温等离子体中的带电粒子的击穿作用和活性氧种的氧化作用所致。

【关键词】 低温等离子体；白色念珠菌；扫描电镜；透射电镜；细菌灭活

在电工领域，利用气体放电可在大气压下方便快捷地产生低温等离子体[1]。低温等离子体已被证明具有很强的杀灭微生物的作用，对细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、病毒、原虫甚至细菌毒素都有很好的杀灭效果[24]。然而，有关等离子体杀灭微生物的机制，目前并不十分清楚。白色念珠菌为条件致病菌，通常存在于人的口腔、上呼吸道、阴道及肠道内，当机体免疫力低下或菌群失调时可引起皮肤黏膜、内脏及中枢神经系统感染[5]。故选择白色念珠菌作为试验对象，具有重要的卫生学意义。
　　
　　本研究以白色念珠菌ATCC10231作为实验菌株，以介质阻挡放电方法产生的低温等离子体对其进行处理，然后进行扫描电子显微镜(scan electron microscope， SEM)和透射电子显微镜(transmission electron microscope， TEM)观察，旨在了解低温等离子体对白色念珠菌外部结构(细胞壁和细胞膜)的影响，初步探讨低温等离子体对白色念珠菌的灭活机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株、主要试剂和仪器

　　白色念珠菌ATCC10231购自军事医学科学院；沙堡氏培养基购自上海市医检所；JSM840扫描电子显微镜(日本电子公司)；H600透射电子显微镜(日本日立公司)。

　　1.2 真菌悬液的准备

　　取白色念珠菌ATCC10231冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量沙堡氏液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL沙堡氏液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养24h。用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于沙堡氏琼脂培养基平板上，于37℃培养24h。挑取上述培养基中第二代典型菌落，接种于沙堡氏琼脂斜面，于37℃培养24h，即为第三代培养物。重复上述操作，培养到第五代。取菌种第五代的沙堡氏琼脂培养基斜面新鲜培养物，吸取5.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，以使白色念珠菌悬浮均匀。采用平板计数法进行活菌培养记数，然后用PBS稀释，最后白色念珠菌的浓度为3.36×106cfu/mL。

　　1.3 低温等离子体对白色念珠菌的处理

　　图1为实验装置示意图，采用介质阻挡放电产生低温等离子体。上、下电极覆盖石英玻璃作为阻挡介质，电极间距设置为3mm，放电电压由高压探头获取。试验在常气压下的空气中进行，在室温20℃、相对湿度60%的环境条件下，将滴有100μL白色念珠菌悬液的盖玻片(24mm×50mm)置于下电极中央(如图1所示)，外加电压处理30s。

　　1.4 SEM观察

　　将载有菌悬液的盖玻片(被等离子体处理后)自然晾干，切取菌悬液部分(10mm×10mm)置于25mL/L的戊二醛固定液中4℃固定2h(固定液内含有0.1mol/L磷酸缓冲液、40g/L多聚甲醛)，0.1mol/L磷酸缓冲液浸洗30min，10mL/L四氧化锇固定液4℃后固定2h(固定液内含有0.1mol/L磷酸缓冲液)，0.1mol/L磷酸缓冲液浸洗10min，用300mL/L乙醇10min，500mL/L乙醇10min，700mL/L乙醇10min，900mL/L乙醇10min×2，1000mL/L乙醇10min×3梯度脱水，醋酸戊酯置换10min，临界点干燥、喷金，扫描电镜下观察、拍照。未处理的对照样本作同样处理。

　　1.5 TEM观察

　　将载有菌悬液的盖玻片(被等离子体处理后)自然晾干，置于25mL/L的戊二醛固定液中4℃固定2h，后续处理同扫描电镜观察。乙醇梯度脱水后，环氧丙烷置换10min，环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片，美兰染色后光学显微镜下定位，进行超薄切片50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察、拍照。未处理的对照样本作同样处理。

　　2 结 果

　　2.1 SEM观察

　　结果显示，正常的白色念珠菌菌体近似圆形，表面光滑，周边完整(图2A)。经等离子体作用30s后，有些菌体和正常对照相比没有变化，有些菌体表面明显出现缺损(图2B)。

　　2.2 TEM观察

　　结果显示，显示正常的白色念珠菌菌体近似圆形，直径约1.2～2.6μm，细胞壁及细胞膜结构完整，细胞壁结构极明显，电子密度较高，胞浆内电子密度均一(图3A)。经低温等离子体处理30s后，白色念珠菌细胞壁和胞浆内电子密度都降低，有的菌体细胞壁及细胞膜断裂，核心溶解，菌体近似空壳(图3B)。

　　3 讨 论

　　低温等离子体灭菌机制包括等离子体物理和细胞分子生物学两个方面，从等离子体物理方面来讲，由于低温等离子体成分复杂，是由离子、电子和中性粒子(原子和分子)、紫外线、活性氧种(reactive oxygen species， ROS)以及射线等所组成的集合体。其中有杀菌作用的成分有带电粒子(离子和电子)、紫外线、ROS以及射线，故究竟哪种成分起主要作用，目前尚存在争议[6]。从细胞分子生物学方面来讲，需要确定等离子体破坏微生物细胞的具体位点，比如细胞壁、细胞膜、细胞中的蛋白质、酶、亚细胞器以及DNA等都有可能是等离子体的作用靶点，而低温等离子体究竟破坏了微生物细胞内哪些组分而导致微生物死亡的目前也不十分清楚。本研究着重从细胞分子生物学方面探讨了低温等离子体对微生物的杀灭机制。

　　电镜观察可以直观的了解生物细胞和组织的超微结构的改变[7]。本研究SEM观察结果显示，低温等离子体明显破坏了白色念珠菌的外部结构(细胞壁和细胞膜)，这可能是低温等离子体中的带电粒子的击穿作用和ROS的氧化作用所致。因为带电粒子在低温等离子体的产生过程中以高速粒子流形式出现，可机械破坏微生物的外部结构。而许多研究表明，ROS的氧化活性很高，可以氧化蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等[89]。TEM观察结果显示，有的菌体核心溶解，菌体近似空壳，这一方面可能是细胞壁和细胞膜被破坏，细胞内容物漏出所致，另一方面可能是低温等离子体中ROS进入菌体细胞内部，与其中的大分子物质(蛋白质、核酸等)反应所致。
　　
　　至于低温等离子体是怎样破坏白色念珠菌的外部结构，以及其中ROS怎样与菌体细胞内部的大分子物质反应，比如，是否将细胞壁中肽聚糖结构破坏了；是否将蛋白质分解成小分子的多肽片段等，目前并不清楚，还需进一步研究。

参考文献

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