利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA

　　　　 作者：李冬民，任吴超，王璇，王飞苗，高玉，韩燕，宁启兰，宋天保，吕社民

【摘要】 　　目的 建立胰腺高质量总RNA快速、经济、稳定的提取方法。方法 应用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺总RNA，通过总RNA含量和A260/280比值的测定及10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的质量，并用RTPCR检测大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶和βactin的表达。结果 利用TRIzol和液氮提取的大鼠胰腺总RNA量可达到3～6μg/mg胰腺组织，A260/280比值在1.75～1.89之间。在10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时，均可见28S及18S条带，并且在28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶、βactin RTPCR产物电泳结果显示均有清晰的条带。结论 应用TRIzol试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总RNA，后者可用于RTPCR研究。

【关键词】 大鼠胰腺；总RNA提取；TRIzol试剂；液氮

　　ABSTRACT: Objective To establish a quick， economical and reproducible method for highquality RNA extraction from pancreas. Methods We utilized TRIzol Reagent and liquid nitrogen to isolate total RNA from the rat pancreas. The RNA quality was determined by detection of its content and optic density (A) at 260/280nm， and electrophoresis in 1% nondenatured agarose gel. Then reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) was performed to detect expression of the pancreasspecific genes. Results The content of the total RNA extracted from the rat pancreas reached 3-6μg/mg pancreatic tissues， and A260/280 ratio was 1.75-1.89. Electrophoresis of the total RNA showed 28S and 18S rRNA bands with clear smear between them. The RTPCR products of pancreasspecific genes including insulin 1， glucagon， αamylase and housekeeping gene βactin all exhibited clear bands on 1% agarose gel， which were located in the expected positions， respectively. Conclusion These results suggest that we have successfully isolated the highquality and intact RNA from the rat pancreas with TRIzol Reagent and liquid nitrogen. The extracted total RNA can be used in RTPCR for pancreatic gene expression.

　　KEY WORDS: rat pancreas; total RNA extraction; TRIzol reagent; liquid nitrogen

　　1968年，COX用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性剂，建立了分离纯化RNA的方法。1979年，CHIRGWIN成功地利用异硫氰酸胍裂解、并以氯化铯为基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中，分离到未降解的RNA，并成为当时提取RNA的主要方法。1987年，CHOMCZYNSKI和SACCHI在联合应用异硫氰酸胍和酚提取RNA的基础上，建立了用酸性异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法分离RNA的方法，由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步骤，分离RNA的时间缩短为4h，不但使RNA的产量和纯度大大提高，而且还可从微量的细胞和组织中提取RNA。这种提取RNA的方法被广泛应用，并且被商业化。尽管目前已能成功地从原核生物、真核生物的多种组织和细胞中提取RNA，但由于胰腺易自溶和富含内源性核糖核酸酶[1]，导致很难获得高质量的胰腺RNA，给研究胰腺组织的基因表达带来很大困难。我们经过反复试验，利用TRIzol试剂和液氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的RNA，可用于RTPCR、Northern blotting、差异显示、抑制性消减杂交及芯片等的研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　SPF级E3雌性大鼠4只，体重220～250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　TRIzol试剂(Invitrogen公司)；反转录试剂盒RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis(Fermentas公司)；Taq DNA polymerase(TaKaRa公司)。蛋白核酸定量仪CE231(GENEGUEST)；凝胶成像系统 (SYNGENE)；PCR热循环仪PTC200(BIORAD)。用PrimerPrimier 5.0设计PCR引物，并由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列见表1。表1 大鼠胰腺中表达的4个基因的引物序列和扩增片段大小（略）

　　1.3 大鼠胰腺的取材和保存

　　取材所用的器械180℃干烤6h，不能干烤的塑料制品用1mL/L DEPC水37℃处理过夜，高压烤干后备用。戊巴比妥钠麻醉E3大鼠， 快速取胰腺尾部组织约20～30mg，装入DEPC处理过的冻存管中，液氮中保存或液氮速冻后-80℃保存备用。

　　1.4 利用TRIzol和液氮提取大鼠胰腺总RNA

　　将胰腺组织从液氮或-80℃低温冰箱中取出，立即放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末，研磨过程中始终保持研钵内有液氮。然后，将胰腺组织粉末移入1.5mL的EP管中，加入1mL TRIzol，剧烈震荡30s，并在室温放置5min。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min，4℃ 12000×g离心15min，样品分为3层：上层无色水相，下层粉红色有机相，中间白膜层。将上清转移至另一新的DEPC处理过的1.5mL EP管中(此步绝对不能吸入中间白膜层)，加入0.5mL异丙醇，混匀后-20℃放置30min。4℃ 12000×g离心10min，弃去上清，用750mL/L乙醇洗涤RNA胶样沉淀。4℃ 7500×g离心5min，室温放置10～15min干燥，加入60μL DEPC水溶解RNA沉淀后80℃保存。若长期保存，RNA也可用无RNA酶的去离子甲酰胺溶解。

　　1.5 大鼠胰腺总RNA定量及A260/280比值鉴定

　　用99μL DEPC水稀释总RNA 1μL后，用核酸/蛋白质微量定量仪检测大鼠胰腺总RNA的含量及A260/280比值。

　　1.6 10g/L非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰腺总RNA

　　电泳RNA 所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用30mL/L过氧化氢溶液浸泡30min，用DEPC水冲洗3遍，室温晾干备用。用对RNA酶有抑制作用的DEPC水配置电泳缓冲液TAE及其他所有溶液。用新的0.5×TAE 配制10g/L琼脂糖凝胶，溴化乙锭(EB)直接加入凝胶中。点样时，样品RNA每2.5μL加入0.5μL 6×上样缓冲液，以5V/cm电压电泳30min左右取出凝胶，在凝胶成像系统观察所提取的RNA并拍照记录。

　　1.7 RTPCR法检测胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶和βactin的表达

　　按照RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明，反转录合成cDNA第一链。逆转录反应体系总体积20μL，含胰腺总RNA 5μg、MMULV逆转录酶(200u/μL)1μL。cDNA合成后保存在-80℃冰箱中备用。

PCR扩增大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶和βactin：取高压灭菌的0.2mL的PCR小管4支，分别依次加入10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture (各2.5mmoL/L) 2μL、Taq DNA polymerase(5u/μL)0.125μL、上下游引物各1μL、cDNA 0.5μL、灭菌蒸馏水17.875μL，反应总体积25μL。混匀后，短暂离心。反应条件：94℃ 5min，94℃ 1min，60.3℃ 1min，72℃ 1min延伸，共32个循环，最后72℃ 10min。产物鉴定：取20μL PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定，用凝胶成像系统进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠胰腺总RNA定量、A260/280比值及10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳结果

　　利用TRIzol试剂和液氮提取的4只E3大鼠胰腺总RNA量可达到3～6μg/mg胰腺组织，A260/280比值在1.75～1.89之间。在10g/L 非变性琼脂糖凝胶电泳时，均可见28S及18S条带，28S与18S条带灰度比值大于1.8，并且在28S和18S条带间可见明显的云雾状阴影(图1)。

　　2.2 RTPCR法检测大鼠胰腺特异性基因的表达

　　RTPCR产物的10g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示，大鼠胰腺特异性表达基因胰岛素1(209bp)、胰高血糖素(492bp)和胰α淀粉酶(318bp)以及管家基因βactin(207bp)均有清晰的条带，未见非特异性扩增(图2)。

　　3 讨 论

RNA的提取是分子生物学中最常用的操作技术之一。由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破坏而降解，加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定，因此抑制核糖核酸酶的活性成为RNA提取过程中的关键问题。常规的组织和细胞RNA的提取要求所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理，以尽量减少外源性RNA酶污染造成的mRNA降解[2]。然而对于易于自溶和富含内源性RNA酶的胰腺组织的RNA提取，常规方法因不能完全抑制RNA酶活性而使胰腺RNA的提取失败。目前，仅有少量文献报道胰腺组织的RNA提取方法，主要有两种：①原位胰腺导管灌注RNA酶抑制剂，然后提取RNA[3]；②将新鲜胰腺组织样品保存于RNAlaterICE中，用液氮或干冰速冻后，提取RNA[45]。第一种方法由于胰腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整RNA关键，因而要求有很高的导管穿刺技术，穿刺失败，则前功尽弃，因而重复性差；第二种方法也是目前研究中主要用的方法，但由于所用试剂较多，步骤繁琐，也不容易在众多实验室推广。

商业所售的TRIzol试剂提取总RNA，实质上是酸性异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法分离RNA[6]。按照TRIzol试剂操作步骤通过匀浆可非常容易地提取多种组织的RNA。如果直接用匀浆法破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织，由于胰腺组织中的细胞不容易迅速与裂解液TRIzol试剂充分接触，RNA酶不能迅速被灭活而致提取的RNA降解。因此，在抑制RNA酶活性的同时，使组织充分的裂解，降解问题也就迎刃而解。RNA酶活性在低温环境(液氮、干冰)或RNA酶抑制剂中可被完全抑制[78]，与干冰和RNA酶抑制剂相比，液氮具有更经济、易于获得的优点。

在研究中，我们利用TRIzol试剂和液氮经过50余次的实践，最终成功提取了大鼠胰腺高质量的总RNA。总RNA定量、A260/280比值测定和10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示，所提取的大鼠胰腺总RNA没有降解，完整性很好。为了进一步鉴定所提取的mRNA的质量及其是否可以用于下游实验，如RTPCR、Northern blotting、差异显示、抑制性消减杂交、芯片等的研究，我们选用RTPCR检测了大鼠胰腺特异性基因的表达。结果显示，不但管家基因βactin条带清晰，而且胰腺内分泌部特异性表达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表达基因胰α淀粉酶，在marker所指示的位置均有清晰的条带，没有非特异性扩增条带。在设计引物时，我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物，从而保证了RTPCR模板来源于mRNA反转录后的cDNA，而非DNA。

　　利用TRIzol和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA的方法，不但经济、简单方便，而且重复性好。但在具体操作中有几点要特别注意：①取胰腺组织的动作一定要快；②胰腺组织在-80℃保存前一定要用液氮速冻；③研磨过程中要及时添加液氮，保证胰腺组织在研磨时一直浸在液氮中，防止mRNA降解；④反转录时也要避免外源性RNA酶的污染。

参考文献

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