HPLCMS法测定兔血浆和组织中丹参素异丙酯的含量

　　　　 作者：张群正，李仲瑾，王世祥，南叶飞，于洁，郑晓晖

【摘要】 　　目的 建立兔血浆及组织中β(3，4二羟基苯基)α羟基丙酸异丙酯(丹参素异丙酯)的高效液相色谱电喷雾离子阱质谱(LCESIMSn)测定新方法。方法 采取液液萃取法处理血浆及组织样品，以4羟基苯甲酸甲酯为内标，LCESIMSn多级反应模式测定血浆及组织中丹参素异丙酯的含量。结果 丹参素异丙酯在血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中的检出限分别为：0.54、1.08、1.20、1.62、2.15、1.12、1.36ng/mL，线性范围分别为：0.20～400、0.10～200、0.01～100、0.02～400、0.20～800、0.01～100和0.05～100μg/mL，日内、日间精密度的相对标准偏差均小于10%，方法平均回收率在89.5%～107.4%范围内。结论 该分析方法灵敏度高、专属性好，为丹参素异丙酯的非临床和临床药代动力学研究提供一种方法学参考。

【关键词】 丹参素异丙酯；HPLCMS；药代动力学

　　ABSTRACT: Objective To establish a new method for the determination of isopropyl 3(3，4dihydroxyphenyl)2hydroxypropanoate (IDHP) in plasma and tissue in rabbits by high performance liquid chromatographyelectrospray iontrap mass (HPLCESIMSn). Methods Plasma and tissue samples were pretreated by liquidliquid method， methyl 4hydroxybenzoate was used as the internal standard， and the multireaction mode was applied to determine the concentration of IDHP in plasma and tissue samples. Results The detecting limits of IDHP in plasma， heart， liver， spleen， lung， kidney and brain were 0.54， 1.08， 1.20， 1.62， 2.15， 1.12 and 1.36ng/mL， respectively; the linear ranges were 0.20-400.0， 0.10-200.0， 0.01-100.0， 0.02-400.0， 0.20-800.0， 0.01-100.0 and 0.05-100.0μg/mL， respectively. The relative deviations for inter and intraday precision were all less than 10%; the average recoveries of the proposed method were within the range of 89.5% to 107.4%. Conclusion The proposed method has the merits of being sensitive and specific， and can be applied in investigating preclinical and clinical pharmacokinetics of IDHP.

　　KEY WORDS: isopropyl 3(3，4dihydroxyphenyl)2 hydroxypropanoate; HPLCMS; pharmacokinetics

　　β(3，4二羟基苯基)α羟基丙酸异丙酯(丹参素异丙酯，图1)是含服复方丹参滴丸后丹参在体内的活性代谢产物之一[12]。丹参素异丙酯具有良好扩张血管、改善脑供血、降低脑梗死面积和减轻水肿等作用，可作为一类新药候选药物进行研究开发[34]。本文旨在建立一种灵敏、快速的含量测定方法，测定丹参素异丙酯的血药浓度及组织分布，为后期非临床及临床药代动力学研究提供方法学参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　新西兰大白兔12只，体重2.0～2.2kg，雌雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(动物合格证号：陕医动字第08018号)。

　　1.2 试剂与仪器

　　丹参素异丙酯对照品(本课题组自制，通过元素分析、红外、质谱、核磁共振确认结构，并测定其纯度达99.4%)；内标物4羟基苯甲酸甲酯购自中国药品生物制品检定所(批号：100278200402)；色谱纯甲醇(美国Fisher公司)；实验用水为超纯蒸馏水(自制)；其他试剂均为分析纯；Agilent公司1100系列高效液相色谱系统(包括二元梯度泵、DAD检测器、Chemistation 4.02工作站)；Agilent公司1100系列SL型离子阱质谱仪、ESI电离源；基因公司Maxima超纯水机；Anke TGL16G型高速离心机；SartoriusBP221s型万分之一电子天平(美国Sartorius公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 试验设计

　　取新西兰大白兔12只，体重2.0～2.2kg，随机分为对照组和实验组，♀♂各半。对照组20.0g/L羧甲基纤维素灌胃，试验组15mg/kg的丹参素异丙酯灌胃给药。实验组于给药后30min立即处死，颈总动脉取全血1mL，冰床上迅速摘取心、肝、脾、肺、肾和脑，液氮冻存。

　　1.3.2 分析条件

　　色谱条件：流动相为乙腈0.084mol/L醋酸水溶液，流速为0.2mL/min，检测波长为280nm，色谱柱为Agilent Zorbax SBC18(150mm×2.1mm)，柱温为30℃；质谱条件：电喷雾离子源；正离子检测；喷雾电压3.5kV；干燥气流速6.0L/min；干燥气温度325℃；雾化气压力3.6kPa；质量扫描范围50～500amu。

　　1.3.3 供试品溶液的制备

　　丹参素异丙酯对照供试品溶液的制备：精密称取丹参素异丙酯对照品5.4mg，甲醇溶解于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，4℃下贮存备用。同法制备浓度为2.1mg/mL内标物供试品溶液；空白血浆供试品溶液的制备：取空白血浆样品1mL，8000r/min离心5min，取上清液0.5mL，加乙腈2mL沉淀蛋白，离心10min(8000r/min)，精密量取上清液2mL置于试管中，氮气吹干，残渣用0.5mL水溶解，乙酸乙酯萃取3次，每次1mL，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用0.5mL甲醇溶解，摇匀，0.45μm滤膜滤过，4℃贮存备用；空白组织样品供试品溶液的制备：取各空白组织样品解冻后，于生理盐水中去除黏连组织，剪碎，称量，分次加入1.5倍量(V∶V)的生理盐水冰浴匀浆，吸取组织匀浆液2mL于玻璃试管中，8000r/min离心10min，量取0.5mL上清液于离心管中，加入100mL/L高氯酸水溶液沉淀蛋白20μL，旋涡混匀2min，8000r/min离心10min，吸取上清液，加入3倍量乙酸乙酯萃取3次，旋涡混匀2min，8000r/min离心10min，吸取上清液，25℃ N2吹干，流动相溶解，0.45μm有机系膜滤过，备用。

　　2 结 果

　　2.1 方法的专属性和检出限

　　拟定分析条件下，含药血浆和混合含药组织样品供试品溶液的总离子流图(图2)。由图2可见，血浆及组织样品中的杂质不干扰丹参素异丙酯的测定。以信号噪音比等于3(S/N=3)计算血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中丹参素异丙酯的检出限分别为：0.54、1.08、1.20、1.62、2.15、1.12、1.36ng/mL。

　　2.2 线性范围

　　取空白血浆和各空白组织适量，分别加入系列丹参素异丙酯对照品供试品溶液和50.0μL内标物供试品溶液，按空白样品制备方法制备样品，在拟定分析条件下进行分析，离子阱质谱多级反应模式(MRM)进行定量。选择m/z 241.2为母离子，m/z 234.1为子离子，内标物选择m/z 153.2为母离子，m/z 136.3为子离子。分别计算丹参素异丙酯和内标物提取离子流图的峰面积，以两者峰面积比值对血浆和组织样品中丹参素异丙酯的浓度进行线性回归，计算线性范围(表1)。表1 线性关系试验结果（略）

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 回收率试验

　　提取回收率：将相同量的丹参素异丙酯对照品供试品溶液和适量内标物供试品溶液分别加入等体积的空白血浆、组织样品溶液及水溶液中，制成相同浓度的丹参素异丙酯血浆样品、组织样品及水溶液。分别按空白血浆和组织样品制备方法制备样品，在拟定色谱条件下，进样20μL，以血浆及组织中丹参素与水溶液中丹参素的含量之比计算提取回收率，得丹参素异丙酯在血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中的提取回收率分别为：101.2%、99.6%、96.3%、104.7%、91.4%、95.3%和92.6%；方法回收率：取空白血浆及组织样品溶液各3份，加入适量的丹参素异丙酯对照品和内标物供试品溶液，分别按空白血浆和组织样品制备方法制备成低、中、高浓度的丹参素血浆及组织样品供试品溶液，在拟定分析条件下，进样20μL，计算血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑样品中方法回收率分别为98.7%、94.3%、104.2%、107.4%、89.5%、91.9%和100.8%。

　　2.3.2 精密度试验

　　取空白血浆和组织样品，加入适量丹参素异丙酯对照品和内标物供试品溶液，分别按空白血浆和组织样品制备方法制备成低、中、高浓度的样品溶液，在1d内按样品测定法重复测定6次，求得日内相对标准偏差分别为：4.3%、6.7%、5.2%、8.1%、2.6%、3.5%和3.9%。将上述3个浓度的样品在6日内陆续各重复测定6次，计算每天的平均值，以6d的平均值求得日间相对标准偏差分别为5.4%、7.1%、4.9%、8.8%、3.9%、4.2%和5.5%。

　　2.3.3 稳定性试验

　　冻融稳定性：将低、中、高浓度的丹参素异丙酯血浆和各组织样品分别置于-20℃冰冻24h后自然解冻，按空白血浆和组织样品制备方法制备样品。在拟定分析条件下，测定丹参素的浓度变化，完全解冻后将样品重新冷冻24h。重复6次，计算冻融周期对样品稳定性的影响，结果发现样品在5个冻融周期内稳定性良好；短期稳定性：将低、中、高浓度的丹参素异丙酯血浆和各组织样品分别在室温下放置4、6、8、10、12、24h，按空白血浆和组织样品制备方法制备样品。在拟定分析条件下，测定丹参素异丙酯的浓度变化，结果发现样品在室温条件下放置24h，各样品中丹参素异丙酯的含量未发生明显变化；长期稳定性：将低、中、高浓度的丹参素异丙酯血浆和各组织样品分别贮存1、2、4、8周后解冻，按空白血浆和组织样品制备方法制备样品。在拟定分析条件下，测定丹参素异丙酯的浓度变化，结果发现冷冻存贮8周，各样品中丹参素异丙酯的含量未发生明显变化;后期稳定性：将低、中、高浓度的丹参素异丙酯血浆和各组织样品供试品溶液，置于室温条件下，分别于0、2、4、8、12、24、48h后进样。在拟定分析条件下，测定丹参素的浓度变化，发现各样品供试品溶液室温条件下，48h内稳定性良好。

　　2.4 血浆及组织样品中丹参素异丙酯的测定

　　分别取1.3.1项中血浆和各组织样品适量，按空白血浆和组织样品制备方法制备供试品溶液。在拟定分析条件下，50μL进样分析，测定血浆及各组织中丹参素异丙酯的含量(表2)。表2 血浆及组织样品中丹参素异丙酯测定结果（略）

　　3 讨 论

HPLCMS法能同时从紫外光谱、总离子流图和提取离子流图3个方面对待测物质进行定性分析，定性比传统液相色谱方法更加准确、可靠。其多级反应模式选择离子定量方法，能有效排出复杂体系中杂质对待测物质的干扰，且灵敏度高，特别适用于药代动力学研究。丹参素异丙酯是一个新的化合物，有关其含量测定方面的报道较少。郑晓晖等[2]建立了人含服复方丹参滴丸后血浆中丹参相关代谢产物的固相萃取高效液相色谱离子阱质谱分析法。然而，对于丹参素异丙酯而言，上述方法仅是一种定性分析方法，在灵敏度和特异性方面很难满足药代动力学研究的需要。

本文采用液液萃取法处理血浆及组织样品，建立了兔血浆及各主要组织中丹参素异丙酯HPLCMS测定方法，其灵敏度高，特异性强，符合美国食品药品监督管理局生物样品分析方法指导原则的要求，可为丹参素异丙酯非临床和临床药代动力学提供方法学参考[5]。

参考文献

　　[1]PEI WJ， ZHAO XF， ZHU ZM， et al. Study of the determination and pharmacokinetics of Compound Danshen Dripping Pills in human serum by column switching liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry [J]. J Chromatogr B， 2004， 809:237242.

　　[2]ZHENG XH， ZHAO XF， ZHAO X， et al. Determination of the main bioactive metabolites of Radix Salvia miltiorrhizae in Compound Danshen Dripping Pills and the tissue distribution of Danshensu in rabbit by SPEHPLCMSn [J]. J Separation Sci， 2007， 30:851857.

　　[3]WANG SP， ZANG WJ， KONG SS， et al. Vasorelaxant effect of isopropyl 3(3， 4dihydroxyphenyl)2hydroxypropanoate， a novel metabolite from salvia miltiorrhiza， on isolated rat mesenteric artery [J]. Eur J Pharm， 2008， 579:283288.

　　[4]TIAN JW， LI GS， LIU ZF， et al. ND309， a novel compound， ameliorates cerebral infarction in rats by antioxidant action [J]. Neur Letters， 2008， 442:279283.

　　[5]US. Department of health and human services， food and drug administration， center for drug evaluation and research (CDER). Guidance for industry bioanalytical method validation [S/OL]. (200105). http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.