神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化

　　　　 作者：孙海飚，刘强，郭敏锋，张华平，陈君长

【摘要】 目的 研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径。方法 分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养；分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂进行干预，诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；传代培养1～2周后，抽提细胞总RNA，用RTPCR检测分化过程中Osterix基因的表达。检测结果重复3次，采用单因素方差分析检测结果。结果 骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6d，采用RTPCR检测发现P物质干预成骨细胞分化，导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix 基因表达，与其他各组比较有显著差异(P<0.05)，Osterix基因表达上调，从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化。而P物质+P物质NK1受体拮抗剂共同干预，Osterix基因表达与空白对照组无显著差异(P<0.05)，说明P物质通过P物质NK1受体对成骨细胞分化进行调控。结论 P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表达促进其向成骨细胞分化。P物质对Osterix基因表达的调控依赖P物质NK1受体。

【关键词】 P物质；成骨细胞；分化；Osterix

　　ABSTRACT: Objective To study the molecular pathway of osteoblastic differentiation induced by substance P (SP)， a neurotransmitter. Methods Mesenchymal stem cells were isolated and cultured， and treated with SP or its receptor (NK1) antagonist to induce osteoblastic cell differentiation， respectively. Alkaline phosphatase activity was determined; Osterix gene expression was detected by RTPCR after 1-2 weeks for three times. The data of each culture condition were analyzed using SPSS12.0 statistical software to determine whether the differences between conditions were significant. Results After 4-5 days culture， bone marrow stromal cells became spindleshaped， triangular or polygonic. They covered the plate surface， formed extensive cell sheets in each group after 11-12 days of culture， and then induced differentiation to osteoblast. SP upregulated the important transcription factor Osterix gene expression significantly (P<0.05). Conclusion The upregulation of Osterix gene expression by SP may stimulate osteoblastic cell differentiation. SPs regulation depends on its receptor NK1.

　　KEY WORDS: substance P; osteoblast; differentiation; Osterix

　　坐骨神经不仅支配下肢骨骼肌，同时还作为神经网络长入骨组织[1]，这些神经纤维包含多种神经递质，目前已在成骨细胞膜表面发现这些神经递质的受体[2]。神经递质P物质在直径很小的初级传入神经中合成，并从末梢神经终端释放[3]。有报道认为：这些神经递质参与骨代谢，包括骨形成与骨吸收[4]，目前研究证实神经递质P物质可以促进与破骨细胞有关的骨吸收，但对成骨细胞有关的骨形成的作用机制仍不清楚。有学者认为：神经递质P物质以剂量依赖的方式促进成骨细胞分化[5]。但也有相反意见认为神经递质P物质抑制了大鼠颅骨的成骨细胞[6]。神经递质P物质NK1受体分布于成骨细胞，最近的研究表明P物质NK1受体在成骨细胞分化的晚期才有表达[7]。但目前神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子机制仍不完全清楚，基于以上研究成果，我们假设：神经递质P物质在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中发挥了重要调控作用，并且是通过NK1受体发挥作用。因此，我们选择骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中关键的调控因子Osterix作为检测对象，试图对神经递质P物质在调控成骨细胞分化过程的分子机制进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 骨髓基质干细胞的分离和培养

　　骨髓组织取自100g Wistar大鼠(由山西医科大学动物实验中心提供)的股骨和胫骨髓腔，用含100mL/L FBS的LDMEM培养液冲洗骨髓腔，反复吹打制成单细胞悬液，经100μm过滤器过滤后，将所得骨髓细胞悬液按106～107个/mL密度接种于25cm2一次性塑料培养瓶中，置37℃、50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养。每隔两日更换培养液(LDMEM+10mol/L FBS+100IU/mL penicillin+100μg/mL streptomycin+1μg/mL amphotericin+0.3mmol ascorbic acid)。

　　1.2 传代培养

　　待细胞汇合80%时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。取生长良好的第三代细胞，以2×104/mL密度接种于24孔培养板中，置于37℃、50mL/L CO2、饱和湿度条件下的孵箱中培养。传代培养3代以上时，将培养细胞分为4组，A组：对照组；B组：向传代培养细胞培养液中加入P物质(10-5mol)；C组：向传代培养细胞培养液中加入P物质NK1受体拮抗剂(10-5mol)；D组：向传代培养细胞培养液中加入P物质(10-5mol)+P物质NK1受体拮抗剂(10-5 mol)进行干预。诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。

　　1.3 碱性磷酸酶活性检测

　　依据HIRATA[8]采用免疫组化方法对4组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性进行检测。在室温下、pH值8.5的10mol/L中性缓冲甲醛孵育的混合液中将细胞固定15min，测量吸光度在410nm左右。蛋白浓度测定使用的是基本能力评估蛋白检测试剂盒(Fermentas， 美国)。

　　1.4 RTPCR检测Osterix基因表达

　　骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中关键转录因子Osterix基因表达采用RTPCR进行检测。传代培养2周后，分别收集上述4组细胞，依照经典总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明书从细胞中提取总RNA，-70℃保存，Du70紫外分光光度计测量A260、A280值，比值应介于1.8～2.0之间。RTPCR反应使用MMLV一步法RTPCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行。内参βactin正义引物：5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′，反义引物：5′AGATCCACAACGGATACATT3′，产物长度270bp；Osterix正义引物：5′CTGGGAAAAGGAGGCACAAAGAA3′，反义引物：5′GGCAAAGTCAGAC GGGTAAG TAG3′，产物长度486bp。反应产物行15g/L琼脂糖凝胶电泳。对凝胶进行DNA光密度扫捕，显色条带经图像分析系统(Alpha Imager 2000)检测其灰度值，与内参的比值为mRNA表达水平参数。

　　1.5 统计学分析

　　各组统计学数据用SPSS12.0统计软件进行分析，数据采用均数±标准差表示，显著性检验采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 成骨细胞培养

　　骨髓基质干细胞被诱导分化为成骨细胞，将传至第三代细胞接种于24孔培养瓶中，每天计数2孔内细胞数，细胞第1天起数量即开始增加，第6天增加幅度最大，至第7天细胞数量趋于平稳。传代培养对数增殖期为4～7d，对数增殖期结束后细胞增生缓慢，进入平台期。图1显示无论是否在培养液中加入P物质，骨髓基质干细胞都分化良好，呈现梭形、三角形等成骨细胞外观。

　　2.2 ALP活性检测

　　我们对分化中的成骨细胞进行了ALP活性测定。成骨细胞接种于24孔培养板，培养14d后，对A、B、C、D 4组细胞进行ALP活性测定。各组成骨细胞表现出了积极的碱性磷酸酶活性，尤其在B组，显示成骨细胞在整个培养期间ALP活性增高更为明显，与其余3组相比有显著性差异(P<0.05，图2)。

　　2.3 RTPCR

　　细胞培养7～14d时，提取细胞总RNA，7d时，未能检测到Osterix表达，14d时，分析电泳条带显示(图3)：A、B、C、D各组转录因子Osterix表达经内参βactin校正后灰度值分别为(0.257±0.013)、(0.375±0.001)、(0.266±0.013)、(0.202±0.017)，采用单因素方差分析，B组与其余各组间Osterix表达有显著性差异(P<0.05)。

　　3 讨论

　　成骨细胞来源于未分化的骨髓基质干细胞，同时骨髓基质干细胞还可分化为软骨细胞，脂肪细胞及成肌细胞等[910]。骨髓基质干细胞首先分化成为前成骨细胞，而后前成骨细胞再分化成为成骨细胞或软骨细胞。体外实验已获得大量成骨细胞分化的调控机制[11]，多种转录因子在成骨细胞分化过程中发挥着决定性作用。骨髓基质干细胞最终分化成为何种细胞是由特殊转录因子的浓度所决定的，转录因子决定着特殊细胞表型的分化途径。例如一种含有锌指结构的转录因子，称为Osterix，被检测出只特定表达于成骨细胞。转录因子Osterix基因编码产物称为特异蛋白7(specific protein 7， Sp7)[12]。同时，Osterix基因敲除小鼠表现为骨质矿化的完全缺失，Osterix被认为存在于Runx2的下游。而Osterix在成骨细胞分化晚期阶段起着决定性作用[12]。

　　有实验报道神经多肽P物质(SP)参与调控骨代谢与骨重建，包括骨形成和骨吸收。SHIH等[5]发现SP对成骨细胞分化的刺激作用，并且具有剂量依赖性，他们同时认为：P物质广泛存在，特别是在中枢及周围神经系统。目前对P物质调控成骨细胞的作用已有研究，并且认为这种作用表现为刺激干细胞有丝分裂，P物质通过增加细胞内mRNA合成、成骨样细胞分化及增强成骨细胞活性来刺激成骨效应。同时，关于成骨细胞膜表面是否存在P物质受体也存在争议，有人检测了前成骨细胞并未发现P物质受体[13]。而最近，GOTO等[7]报道P物质受体表达于培养的颅骨骨髓基质干细胞分化晚期阶段，而在分化早期，前成骨细胞表面并未检测到P物质受体。我们在实验中分别用P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂对骨髓基质干细胞进行干预，并对培养中的骨髓基质干细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测。ALP是成骨细胞分化早期的标志物之一，体外实验已经证实成骨细胞分化过程中ALP活性增强[14]。一些调控因子可以提高MC3T3E1成骨细胞分化过程中DNA合成及ALP活性[15]。实验中我们发现：10-5mol P物质可以刺激成骨细胞ALP活性增强。因此，认为在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中，P物质发挥了促进作用。
　　
　　我们同时采用RTPCR技术对传代培养14d的骨髓基质干细胞进行了Osterix基因表达的检测。通过3次检测发现：经P物质干预可以显著上调Osterix基因表达。由此说明神经递质P物质可以刺激前成骨细胞分化为成骨细胞，而这作用发挥于成骨分化的晚期阶段，即前成骨细胞向成骨细胞分化阶段，主要表现为显著上调了成骨细胞分化过程中转录因子Osterix的基因表达。同时，10-5mol P物质联合10-5mol P物质NK1受体拮抗剂并未对Osterix基因表达产生影响。说明P物质的这种成骨刺激效应是通过NK1受体发挥作用的。这与P物质NK1受体仅表达于成骨细胞是一致的。
　　
　　神经递质P物质对成骨细胞的分化具有刺激作用，但这种成骨效应仅表达于成骨细胞分化晚期，这是因为P物质NK1受体仅表达于成骨细胞分化晚期，而P物质对成骨细胞的分化产生作用依赖其NK1受体。

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