帕金森病大鼠脚桥核中胆碱能M2受体的表达变化及意义

　　　　 作者：惠艳娉，向莉，张巧俊，央珍，李小颖，吴仲恒，袁海峰

【摘要】 目的 通过免疫组织化学方法观察胆碱能M2受体在帕金森病(Parkinsons disease， PD)模型大鼠脚桥核(pedunculopontine nucleus， PPN)中的表达变化，探讨胆碱能M2受体在PD发病机制及病理生理改变中的作用。方法 选用健康雄性SD大鼠16只，随机分为2组。取脑组织固定后作连续冠状冰冻切片。以鼠源M2单克隆抗体为一抗，采用免疫组化SP法，镜下控制显色。以阳性细胞计数及平均光密度为分析指标，对M2受体在PD模型大鼠PPN中的表达变化进行观察分析。结果 对照组大鼠PPN部位及PD大鼠未损毁侧PPN部位均表达比较丰富的M2受体阳性细胞。PD大鼠损毁侧PPN部位M2受体阳性细胞明显稀疏。与对照组和PD大鼠未损毁侧相比有明显差异(P<0.05)。3组间阳性部位的表达强度无明显差异(P>0.05)。结论 PD状态下PPN内存在表达M2受体的神经元变性死亡或受体脱失。而其余未发生变性死亡或受体脱失的M2受体阳性神经元其表达强度并不受影响。同时发现，影响PPN内M2受体阳性细胞变化的因素具有单侧性。

【关键词】 帕金森病；6羟多巴胺；脚桥核；胆碱能M2受体

　　ABSTRACT: Objective To investigate the altered expression of muscarinic receptor 2 (M2 receptor) in the pedunculopontine nucleus (PPN) of Parkinsons disease (PD) model rat by immunocytochemical technique and explore the role of M2 receptor in etiopathogenesis and pathophysiological changes of PD. Methods Sixteen healthy SD rats were pided randomly into two groups. Rat monoclonal antibody against the M2 receptor was used. Then we used positive cell counting and optical density as indicators to analyze the altered expression of M2 receptor in PPN of PD model rats. Results The counting of M2 receptor positive cells in the PPN was not obviously changed in normal rats and the unlesioned side of PD rats (P>0.05)， whereas a significant decrease was observed when compared to that in normal rats and the lesioned side of PD rats， respectively (P<0.05). However， the positive intensity in the three groups did not differ significantly. Conclusion The results indicate that there was a degenerative death or receptor loss of M2 receptor positive cells in the lesioned PPN of PD rats. The expression intensity of M2 receptor positive cells without degenrative death or receptor loss was not affected. It was also found that the factor affecting the change of M2 receptor positive cells in the PPN involved only one side.

　　KEY WORDS: Parkinsons disease; 6hydroxydopamine; pedunculopontine nucleus (PPN); M2 muscarinic receptor

　　帕金森病(Parkinsons disease， PD)是一种进行性的神经系统变性性疾病。病理变化为黑质致密部(substantia nigra pars compacta， SNc)的色素脱失和多巴胺能(dopamine， DA)神经元的大量死亡，继之引发基底节功能环路调控异常[12]。脚桥核(pedunculopontine nucleus， PPN)位于中脑脑桥被盖区，由形态和功能上异质性的多类神经元组成。其中数量最多的为胆碱能神经元，PPN神经元上有M2、M3和M4受体亚型表达，其中以M2居多[35]。研究表明PD中步态和姿势的变化或者还包括强直和运动过缓都与PPN的变化相关[34]。以往的研究显示胆碱能受体激动剂可抑制PPN胆碱能神经元进而导致运动减少，认为PPN中的M2受体主要对PPN神经元活动起抑制性的调节作用[67]。但新近的一些研究发现，在高浓度胆碱能受体激动剂作用下，M2受体也可对细胞起兴奋作用[78]。然而关于PD时PPN中M2受体的变化目前报道并不多。为此，本实验通过免疫组织化学方法观察胆碱能M2受体在PD模型大鼠PPN中的表达变化，探讨胆碱能M2受体在PD发病机制及病理生理改变中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　实验选用健康雄性SD大鼠(260～325g)16只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。大鼠在标准环境饲养，室温20～25℃，24h昼夜循环光照，自由摄食饮水，预养1周后，随机分为对照组(n=8)和PD组(n=8)。

　　1.2 模型的建立和检验

　　以PaxinosWatson大鼠脑立体定位解剖图谱[9]为依据，选健康雄性SD大鼠，采用改进的微量注射器与空心玻璃微电极结合的6羟多巴胺(6hydrodopamine， 6OHDA)两点脑内微量注射法(坐标：前囟后AP -4.8～5.3mm；矢状缝右旁开1.8～2.3mm；颅骨膜下D 7.1～7.3mm)，选择性损毁右侧SNc的DA能神经元。术后1周行阿朴吗啡(apomorphine， APO)皮下注射检测旋转行为，若大鼠在注药后即出现向损伤对侧(左侧)旋转，计数10min，以5min内累计≥20转，视为成功的偏侧PD大鼠模型。

　　1.3 免疫组织化学染色

　　1.3.1 灌注取材

　　200g/L乌拉坦(1.2g/kg体重)过量腹腔麻醉。自胸骨处V形剪开胸腔暴露心脏，轻牵心脏自左心室插入粗针头，迅速剪开右心耳先以37℃ 2g/L肝素生理盐水100mL快速灌注，继之再灌注新配制的40g/L多聚甲醛和2g/L苦味酸的磷酸缓冲液(0.1mol，pH 7.4)500mL，快速2min后再放慢约60min灌注固定。自枕骨大孔处开颅取出完整脑组织。

　　1.3.2 后固定

　　脑组织修块后置于40g/L多聚甲醛溶液于4℃冰箱中固定3～4h后入100g/L→200g/L→300g/L蔗糖溶液每步至沉底。

　　1.3.3 切片

　　适当修块，OCT包埋于恒温冷冻切片机约20min后做连续冠状切片，片厚50μm，入磷酸盐缓冲液溶液(PBS 0.1mol，pH 7.4)。

　　1.3.4 SP染色

　　①PBS(0.1mol，pH 7.4)多次洗涤。②3g/L h3O2溶于PBS(0.1mol，pH 7.4)避光10～30min。③PBS(0.1mol，pH 7.4)10min×3充分洗涤。④30g/L正常羊血清蛋白37℃恒温箱45min弃去不洗。⑤1∶500鼠源M2单抗以2g/L TritonX100PBS稀释4℃ 48h。⑥PBS(0.1mol，pH 7.4)10min×3。⑦羊抗鼠二抗工作液室温2h。⑧PBS(0.1mol，pH 7.4)10min×3。⑨SP工作液室温2h。⑩PBS(0.1mol，pH 7.4)10min×3。DAB显色3～10min(镜下观察控制反应强度)，PBS终止显色。

　　1.3.5 裱片封片

　　将切片裱于预先处理好的载玻片上，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每批染色设置空白对照(以PBS缓冲液代替一抗进行试验)。

　　1.4 图像分析

　　①在明视野显微镜下认定PPN结构部位，以胞膜轴突含棕黄色颗粒者为阳性细胞，经HPIAS1000型全自动医学彩色图像分析系统在高倍镜下计数3个视野范围PPN结构部位阳性细胞数，每只大鼠3张脑切片计数后取平均数(以PPN最大截面为中心，前后连续取片)。②经ImagePro Plus 6.0图像分析系统，对上述阳性表达部位进行吸光度测定，每组标本随机取10个阳性表达部位测定后取平均值。

　　1.5 统计处理

　　应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)进行检验，两组之间比较采用LSDt检验。α取0.05，即以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PPN免疫细胞学变化

　　①对照组大鼠PPN部位表达比较丰富的M2受体阳性细胞(图1)，PD大鼠未损毁侧组PPN部位M2受体阳性细胞表达也比较丰富(图2)，两者相比较无明显差异(P>0.05)。而PD大鼠损毁侧组PPN部位M2受体阳性细胞明显稀疏(图3)，与对照组和未损毁侧相比有显著性差异(P<0.05)。②3组中阳性部位的表达强度无统计学意义(P>0.05)。③M2受体的表达主要集中在细胞膜及轴突上(图4)。

　　2.2 图像分析结果

　　2.2.1 大鼠PPN内M2受体阳性表达细胞计数的比较

　　SNc偏侧损毁后大鼠损毁侧PPN内M2受体阳性表达细胞数目减少，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；而未损毁侧PPN内M2受体阳性表达细胞计数与对照组相比无明显改变(P>0.05，表1)。表1 大鼠脚桥核M2受体阳性表达细胞计数及细胞免疫反应产物强度分析结果（略）

　　2.2.2 大鼠PPN内M2受体阳性表达细胞免疫反应产物强度的比较
　　SNc偏侧损毁后大鼠损毁侧、未损毁侧及对照组三者M2受体阳性表达部位的平均光密度变化无统计学差异(P>0.05，表1)。

　　3 讨论
　　
　　PPN位于上小脑脚周围，由胆碱能和非胆碱能神经元组成，其中胆碱能神经元细胞群占90%以上[3，8]。PPN具有广泛的纤维联系，它的传出纤维上行投射至丘脑、黑质致密部和丘脑底核，下行纤维投射到中脑网状结构、小脑和脊髓颈、胸段；同时它也接受来自苍白球内侧部、黑质网状部、丘脑底核和大脑皮质的传出纤维投射[2，10]。PPN与运动和感觉的调节、肌张力的控制及睡眠觉醒都有密切的关系。已有研究显示PD状态下PPN神经元自身代谢活动发生变化，同时其具有兴奋和抑制性传入投射纤维间的平衡较正常状态也有显著改变[8，1011]。已知PPN神经元上有多种胆碱能受体亚型表达，以M2居多，M2受体位于突触前膜或/和突触后膜，具有自身受体的特性，对递质的释放和神经元的活动起着复杂的调节作用[56]。我们前期的研究显示PD状态下PPN神经元放电频率显著增加、不规则放电增加[12]，而胆碱能M2激动剂对PPN神经元有抑制作用、拮抗剂对PPN神经元有抑制作用[7]，说明胆碱能M2受体可通过直接和间接作用对PPN神经元的电活动进行调节。本实验结果显示SNc偏侧损毁后大鼠损毁侧PPN内M2受体阳性表达细胞数目明显减少，进一步证明在PPN的功能活动中胆碱能递质系统具有重要的作用。PD形态学研究显示PD状态下PPN有相当多的胆碱能神经元变性坏死[34]，那么PD状态下PPN内M2受体阳性表达细胞数目减少的原因可能与此有关。PD状态下由于PPN内M2受体阳性表达细胞数目减少，M2受体对PPN神经元活动的抑制性调节作用减弱，这可能是PD时丘脑底核(Subthalamic nucleus， STN)过度活跃及基底节输出核团去抑制的原因之一。我们实验中还发现未发生变性死亡或受体脱失的M2受体阳性神经元，其M2受体表达强度并不受影响，表明单从M2受体的调节机制上其活动可能不受影响。该结果可能还间接表明，影响PPN内M2受体阳性细胞变化的因素具有单侧性。
　　
　　同时有报道指出PD中脚桥核致密部(pedunculopontine nucleus， pars compacta， PPNc)神经元的缺失程度与SNc神经元缺失相似，提示PPN神经元可能对引起SN的DA能神经元变性的病理机制有相同的易感性[12]。MENASEGOVIA等[8]的研究表明PPN的解剖结构及电生理特性与SN很相像，比如它们均存在有网状部和致密部。最近有研究表明，PD时PPN形态改变发生的时间与黑质相同，均在疾病病程中期[4]。那么，PPN的这种神经元变性究竟是PD的始发因素还是继发于PD一系列的功能递质异常之后，尚需要进一步的实验研究证实。由于M2受体表达部位的多样性及PPN内外环路功能的复杂性，PD状态下PPN整体活动变化及机制还有待于更多的实验研究讨论。

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