环氧合酶2介导四氢大麻酚抑制CA1区长时程抑制的作用

【摘要】 目的 探讨环氧合酶2(cyclooxgense2， COX2)在四氢大麻酚(Δ9tetrahydrocannabinol， Δ9THC)抑制CA1区长时程抑制(longterm depression， LTD)中的作用。方法 在小鼠腹腔注射Δ9THC(10mg/kg)或COX2的选择性抑制剂NS398(10mg/kg)24h后切片，在海马CA1区记录场电位EPSP(fEPSP)，观察NS398和Δ9THC在LTD中的作用，并结合全细胞膜片钳技术观察THC对神经元膜兴奋性的影响。结果 ①给予低频电刺激(1Hz，15min)诱导CA1区LTD，Δ9THC可显著降低LTD。②Δ9THC并不改变海马CA1区基本的突触传递和膜的基本电学特性(包括膜电位、输入阻抗及放电特性)。③Δ9THC显著降低LTD的效应可被COX2的选择性抑制剂NS398所反转。④在COX2基因敲除的小鼠，Δ9THC降低LTD的作用被显著抑制。结论 在CA1区COX2介导了Δ9THC降低LTD的作用。

【关键词】 环氧合酶2；四氢大麻酚；长时程抑制; 突触传递；海马

　　ABSTRACT: Objective To explore the role of cyclooxgense2 (COX2) in tetrahydrocannabinol (THC)induced inhibition of longterm depression (LTD) in CA1 area in vitro. Methods The hippocampal slices were prepared at 24h after intraperitoneal injection of Δ9THC (10mg/kg) or COX2 inhibitor NS398 (10mg/kg). Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) were recorded in the stratum radiatum of the CA1 area in vitro to observe the effect of NS398， a selective inhibitor of COX2， on the THCinduced inhibition of LTD and THCs effect on membrane excitability in pyramidal neurons by using the wholecell patch clamp technique. Results ① Lowfrequency stimulation (1Hz， 15min) inducedLTD in CA1 area was significantly attenuated by Δ9THC. ② Δ9THC did not affect the basal synaptic transmission and membrane excitability (including membrane resting potentials， input resistance and firing property). ③ THCinduced inhibition of LTD was reversed by NS398. ④ THCinduced inhibition of LTD was robustly impaired in COX2 knockout mice. Conclusion THCinduced inhibition of LTD in CA1 area was mediated via COX2.

　　KEY WORDS: cyclooxgense2(COX2); Δ9THC; longterm depression(LTD); synaptic transmission; hippocampus

　　桑科植物大麻(marijuana)是全球最为广泛非法吸食的毒品之一，四氢大麻酚(Δ9tetrahydrocannabinol， Δ9THC)是大麻中引起精神作用的主要活性成分，大麻的使用会导致身心的不良后果[1]，然而Δ9THC如何影响突触和认知功能还有待进一步阐明。Δ9THC通过作用于中枢神经系统的大麻素受体CB1起作用[23]，大麻素受体的发现促进了对其内源性配体的研究，内源性大麻素(endocannabinoids)通过与G蛋白藕联的CB1受体的激活促进记忆和突触的可塑性[4]。长时程抑制(longterm depression， LTD)与长时程增强(longterm potentiation， LTP)[5]一样是一种与学习和记忆有关的活动依赖性突触可塑性的形式。研究表明Δ9THC对在伏隔核和外侧杏仁核区低频电刺激(low frequency stimulation， LFS)诱导的LTD起阻断和抑制作用[68]。环氧合酶2(cyclooxygenase2， COX2)是一种将花生四稀酸转化为前列腺素的关键酶，主要在突触后的树突棘表达[910]。但Δ9THC在海马LTD中的作用机制尚不清楚。本研究拟观察Δ9THC在海马CA1区LFS诱导的LTD中的作用及COX2是否介导其效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 海马脑片准备

　　采用C57BL/6(Charles River)和COX2(-/-)小鼠(Jackson Laboratory)，雌雄不拘，年龄10～17d，体重6～9g。分组情况：①取15只C57BL/6小鼠随机分为3组，分别腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)复合溶剂对照(Veh，由Tween 80、DMSO 和生理盐水按照1∶2∶7的比例配制)、Δ9THC(10mg/kg)、NS398(NS，10mg/kg)＋Δ9THC(10mg/kg)，注射后24h将小鼠断头处死制作海马脑片，每只小鼠制备的脑片取1～2片用于记录fEPSP；②取16只C57BL/6小鼠随机分为2组，分别腹腔注射溶剂对照和Δ9THC，每只小鼠制备的海马脑片取2～4片用于测定输入输出功能及膜的基本特性实验；③取10只COX2(-/-)小鼠随机分为2组，分别腹腔注射溶剂对照和Δ9THC，每只小鼠制备的海马脑片取1～2片用于记录fEPSP。海马脑片的制备如文献所述[10]。小鼠断头后取脑并迅速置于0～4℃以950mL/L O2、50mL/L CO2混合气饱和的低Ca2+/高Mg2+的切片用液(mmol/L)：2.5 KCl， 7.0 MgCl2，28.0 NaHCO3，1.25 Nah3PO4，0.5 CaCl2，7.0葡萄糖，3.0丙酮酸，1.0抗坏血酸和234蔗糖。脑片被切成350μm厚的薄片，将其转移到被氧饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid， ACSF)中进行孵育，ACSF的组成为(mmol/L)：125.0 NaCl，2.5 KCl，1.0 MgCl2，25.0 NaHCO3，1.25 Nah3PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖，3.0丙酮酸和1.0抗坏血酸，在36℃孵育0.5～1h，然后置于室温(22～24℃)至少1.5h后可进行电生理记录。记录时将脑片转移至记录槽，并在32～34℃持续被950mL/L O2、50mL/L CO2混合气饱和的ACSF灌流(灌流速度约为2mL/min)。在配有×60的入水镜头和微分干涉相差显微镜的直立显微镜(Olympus BX51WI)下观察CA1区的锥体细胞。

　　1.2 主要试剂

　　Δ9THC贮存于乙醇溶液，浓度为200mg/mL，用氮气挥发完乙醇后溶解于等量的DMSO，然后用复合溶剂(由Tween 80、DMSO和生理盐水按照1∶2∶7的比例配制)稀释Δ9THC为2mg/mL的应用液(Hoffman ，et al. 2003; 2007)。NS398溶解于DMSO。

　　1.3 电生理记录

　　刺激Schaffer侧枝纤维，刺激频率0.05Hz。在Axoclamp2B膜片钳放大器的桥式整流模式(bridge mode)下，在CA1区放射层记录场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential， fEPSP)[4]。细胞外液组成为(mmol/L)：130.0 NaCl，2.5 KCl，1.0 MgCl2，10.0 HEPES，1.25 Nah3PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖(pH 7.4)。记录电极充灌ACSF (2～4MΩ)，置于CA1区放射层，取引起fEPSP最大反应三分之一的刺激作为基线的刺激强度。所有的浴槽灌流液均含有荷包牡丹碱(bicuculine， 10μmol/L)以阻断GABAA受体介导的反应。

　　膜片钳记录在Axoclamp2B放大器的桥式整流模式下进行。电极内液组成为(mmol/L)：120葡萄糖酸钾，20 KCl，4 NaCl，10 HEPES，0.5 EGTA，0.28 CaCl2，4 Mg2ATP，0.3 Tris2GTP和14磷酸肌酸(用KOH校准pH为7.25)。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据以均数±标准误表示，均数间差异的显著性检验用Students ttest及方差分析(ANOVA)，在需要时可结合学生NewmanKeuls检验进行统计学差异比较。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 THC抑制海马CA1区LTD

　　腹腔注射溶剂对照24h后将小鼠断头，获得用做实验记录的脑片。记录到稳定的fEPSP至少20min作为基线，给予1Hz 15min的低频刺激(low frequency stimulation， LFS)以诱导LTD。LFS后36～40min fEPSP的斜率为(0.81±0.02)%(n=8， 图1)；而i.p THC后，LTD被显著抑制，LFS后36～40mins fEPSP的斜率为(0.97±0.04)% (n=8， 图1)。结果表明THC对海马CA1区LFS诱导的LTD具有抑制作用。

　　2.2 THC不改变CA1区基本的突触传递

　　由于腹腔注射THC对CA1区的LTD存在抑制作用，为探究是否由于THC改变了CA1区基本的突触传递所致，测定了CA1区的输入输出功能(inputoutput function test)。如图2所示，注射THC后并不改变基本的突触传递。因此图1所示THC对LTD的抑制效应是THC本身对LTD的效应，并非是由于改变了CA1区神经元基本的突触传递。

　　2.3 THC不改变CA1区神经元膜的基本特性

　　为确定THC对LTD的抑制效应是否是由于其改变了膜的基本特性所致，分别测定了腹腔注射溶剂和THC条件下膜的静息电位、输入阻抗及神经元的放电特性等。如图3所示，腹腔注射THC不改变CA1区神经元的放电特性和膜的静息电位及输入阻抗等基本特性。

　　2.4 THC抑制LTD的效应为COX2的抑制剂所反转

　　为阐明COX2是否参与了THC诱导的LTD的抑制效应，i.p注射COX2的抑制剂NS398以观察其对THC诱导的LTD抑制效应的影响。注射NS398后，LFS后36～40min fEPSP的斜率为(0.84±0.03)% (n=10，图1)，与对照组相比，P>0.05。此结果表明COX2的抑制剂NS398反转了THC抑制LTD的效应，提示COX2介导了THC对LTD的抑制效应。

　　2.5 THC对COX2基因敲除小鼠的LTD无抑制效应

　　为证实COX2介导了THC对LTD的抑制效应，在COX2基因敲除的小鼠分别注射溶剂和THC后观察fEPSP斜率的变化。在注射溶剂的COX2(-/-)小鼠，LFS后36～40min fEPSP的斜率为(0.80±0.05)%(n=10，图4)，而注射THC后的COX2(-/-)小鼠，其相应时间点的斜率为(0.75±0.03)% (n=9，图4)，与对照组相比无差异。结果证实THC对LTD的抑制效应是由COX2介导的。

　　3 讨论
　　
　　在CNS内源性大麻素主要通过与CB1受体结合起作用，而CB2受体在免疫系统表达丰富[23]。Δ9THC是大麻中引起精神作用的主要活性成分，主要通过作用于CB1受体调制神经元的突触传递和可塑性[23]。在伏隔核和外侧杏仁核的研究表明，在体伏隔核单次使用Δ9THC可阻断内源性大麻素介导的兴奋性突触传递的LTD，在海马则可阻断内源性大麻素介导的抑制性突触传递的LTD，且可诱发CB1受体的功能耐受[6]；而在体反复使用Δ9THC 7d可消除在伏隔核诱导的LTD[78]和CA1区LTP[11]。本研究结果表明，Δ9THC可显著降低海马CA1区LTD，这一结果与在伏隔核和外侧杏仁核的研究报道相一致，而且Δ9THC本身并不改变海马CA1区基本的突触传递和膜的基本特性 (包括膜电位、输入阻抗及放电特性)。
　　
　　COX2是一种将花生四稀酸转化为前列腺素的关键酶，主要在突触后的树突棘表达[9]。COX2与海马长时程的突触可塑性有关[10]，抑制COX2可显著抑制海马齿状回由LFS诱导的LTD[12]。然而Δ9THC诱导的长时程突触可塑性变化的机制尚不清楚。本研究发现Δ9THC抑制海马LTD的效应能被COX2的选择性抑制剂NS398翻转，而且这一效应在COX2基因敲除的小鼠中被证实。上述研究为COX2在海马介导Δ9THC抑制海马LTD的作用提供了证据，这将有助于理解成瘾性药物在修饰神经环路方面的作用机制，为寻找治疗毒品成瘾的有效药物开辟了新思路。

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