MMP2/TIMP2系统与原发性开角型青光眼的相关性分析

【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2/金属蛋白酶组织抑制因子2(MMP2/TIMP2)系统在原发性开角型青光眼中的可能发病机制。方法 正常人尸眼20只，中期原发性开角型青光眼患者20只眼，晚期原发性开角型青光眼22只眼，均行常规小梁切除术，采用RTPCR法检测小梁网组织中MMP2 mRNA和TIMP2 mRNA的表达。结果 正常人和中、晚期原发性开角型青光眼小梁网均有MMP2 mRNA和TIMP2 mRNA的表达；MMP2 mRNA在正常人小梁网呈高表达，在原发性开角型青光眼中表达明显下调，且随病程发展其表达逐步降低；TIMP2 mRNA在正常人小梁网呈低表达，在原发性开角型青光眼中表达明显上调，且随病程发展其表达逐步升高；原发性开角型青光眼小梁网MMP2 mRNA/TIMP2 mRNA比值明显低于正常人，且随病程发展比值逐步减小。结论 小梁网细胞外基质TIMP对MMP的异常抑制，造成MMP2/TIMP2系统的失衡，可能是原发性开角型青光眼的发病机制之一。

【关键词】 原发性开角型青光眼；小梁网；细胞外基质；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶抑制因子2

原发性开角型青光眼(primary openangle glaucoma， POAG)是常见的致盲性眼病之一，迄今为止，其病因及发病机制尚不清楚。目前，认为小梁网房水排出阻力增加致眼压升高是造成POAG视神经损害的主要原因。小梁网内皮细胞上的沉积物称为细胞外基质(extracellular maxtrix， ECM)，由小梁细胞产生，对维持房水正常流出十分重要。基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制物(MMPs/TIMPs)体系维持正常是ECM产生和降解保持动态平衡的重要调控机制。当MMPs/TIMPs比例发生改变时，会影响ECM的降解[12]。MMP2可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型胶原。有研究证实，小梁网ECM中有MMP2的表达，因此可能同时存在TIMP2对MMP2的调控。为证实我们的推测，本研究通过RTPCR的方法检测人原发性开角型青光眼小梁网中MMP2 mRNA/TIMP2 mRNA的表达，探讨MMP2 mRNA/TIMP2与原发性开角型青光眼的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　早期原发性开角型青光眼的治疗原则以药物治疗为主，故未纳入研究范围。选择2004年～2006年在湘雅医院青光眼专科确诊的经药物治疗眼压控制不良的中、晚期原发性开角型青光眼、并行常规小梁切除术的患者共42人42只眼。其中中期原发性开角型青光眼患者20人20只眼，男12例，女8例，年龄(42.53±14.63)岁；晚期原发性开角型青光眼患者22人22只眼，男13例，女9例，年龄(45.16±18.25)岁。中、晚期原发性开角型青光眼的纳入标准采用中华眼科学会青光眼学组制定的标准[3]。采用健康意外死亡、并在生前同意并签署《眼球器官捐献自愿书》者10人20只眼，男14例，女6例，年龄(39.26±13.42)岁，自愿者均在签署同意书后行眼科系统检查，结果正常者纳入研究。所有研究对象经裂隙灯显微镜及眼底镜检查，未见屈光间质混浊及青光眼以外的其他眼病；色觉正常；瞳孔自然大小；无高、低血压，糖尿病等全身性疾病。

　　1.2 主要仪器及试剂

　　RTPCR逆转录试剂盒、dNTPs、Taq聚合酶等购自美国Fermentas公司；Marker、溴乙锭、载样缓冲液等为北京鼎国生物技术发展中心产品。480型PCR热循环仪(美国Perkin Elmer公司)；DYYⅢ稳压稳流微型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)；PCR凝胶成像系统(Eagle Eye Ⅱ图像处理系统)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本采集

　　纳入研究范围的中、晚期原发性开角型青光眼患者、正常人尸体新鲜离体眼球均在眼科显微镜下行常规小梁切除术，切取小梁组织1mm×2mm大小，快速标记并放入液氮中冷冻保存，后移入-70℃深低温冰箱中保存，备用。

　　1.3.2 小梁组织mRNA的RTPCR半定量检测

　　MMP2及TIMP2引物序列参照文献[4]，由华大基因上海鼎安生物科技有限公司合成。采用大连宝生总RNA提取试剂盒提取各组小梁组织细胞总RNA。各组总RNA 2μg，按RTPCR试剂盒说明书，逆转录为cDNA后进行PCR。PCR反应条件：94℃预变性5min，92℃变性90s，58℃退火1min，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取6μL PCR产物以15g/L的琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH为内参照，进行吸光度定量分析，数值以MMP2、TIMP2与GAPDH的吸光度比值表示mRNA表达的相对含量。凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，凝胶成像系统半定量分析DNA含量。

　　1.4 统计学处理

　　所有统计均使用Mstatistica统计软件。MMP2 mRNA、TIMP2 mRNA表达的比较采用方差分析；三组MMP2 mRNA/TIMP2 mRNA表达比值的比较采用秩和检验；相关性分析采用Spearman相关性分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 三组MMP2 mRNA、TIMP2 mRNA表达的比较

　　MMP2 mRNA在正常组表达较高，在中、晚期青光眼组表达明显下调，差异显著(P<0.01)；TIMP2 mRNA在正常组表达较低，在中、晚期青光眼组表达明显上调，差异显著(P<0.01)；MMP2 mRNA与青光眼病程的发展呈负相关性(r=-0.89，P<0.05)，TIMP2 mRNA表达与青光眼病程的发展呈正相关性(r=0.93，P<0.05，表1)。表1 三组MMP2 mRNA、TIMP2 mRNA表达的比较（略）

　　2.2 三组MMP2 mRNA/TIMP2 mRNA比值的比较

　　正常组该比值较高(2.011±0.251)，中、晚期青光眼组比值明显降低(0.539±0.043，0.277±0.039)，差异有统计学意义(P<0.01)，并随青光眼病程的发展，该比值有逐渐降低的趋势(r=-0.95，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　在各型青光眼中，原发性开角型青光眼的患病率在我国居第2位。其病因主要是前房角小梁网病变，致房水通过该处流出眼外的阻力增大，眼压升高。小梁网ECM的异常堆积是房水流出阻力增加的最重要的因素。ECM主要由胶原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和弹力纤维等物质组成，除作为间充组织填充细胞间隙外，尚通过细胞膜受体等在细胞间信号转导过程中起重要作用。ECM产生与降解是一个非常复杂、严格调控的生物学过程，有赖于调节其合成与代谢的酶之间的动态平衡，其中以MMPs/TIMPs系统调节最重要。国内尚未见到关于MMP/TIMP在原发性开角型青光眼小梁网中的表达及调控机制的研究报道。
　　
　　MMPs是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶，其主要功能是降解ECM和基底膜。MMP在正常组织中表达水平很低， 以酶原形式分泌，活化后才能起作用。MMPs家族目前已发现至少20个成员。有研究证实正常人小梁网有MMP2的表达[5]。本研究结果证实，正常人和原发性开角型青光眼小梁网上均有MMP2的表达，与BRADLEY等[67]研究结果一致；原发性开角型青光眼小梁网上MMP2表达很弱，且随青光眼病程的进展，MMP2的表达进一步下降。说明正常人小梁依赖MMP2的高表达降解小梁网ECM，维持小梁网筛网状高通透性，房水流出通畅，眼压得以维持正常；在原发性开角型青光眼中由于MMP2表达下降，其降解小梁网ECM的功能下降，导致ECM在小梁网处异常的、过多的堆积，小梁网通透性下降，房水流出阻力增加，眼压升高；随着青光眼病程进展，MMP2表达逐步明显降低，小梁网ECM堆积进一步增加，小梁网通透性进一步下降，眼压持续升高，终致病程发展至晚期青光眼。
　　
　　TIMPs是MMPs的天然抑制剂，不同的TIMP对MMP的活性抑制具有特异性。TIMP2是相对分子质量21000的蛋白分子，但不形成糖基化，其氨基酸序列约有40%与TIMP1相同，广泛表达于多种组织中[8]。本研究结果显示，正常人和原发性开角型青光眼小梁网均有TIMP2的表达，正常人表达量较低，原发性开角型青光眼表达明显上调，并随青光眼病程的发展其表达逐步上调。说明TIMP2多随MMP2的表达而表达。正常人TIMP2表达低，其抑制MMP2的功能弱，MMP2表达相对较高，逐降降解ECM维持小梁网高通透性；原发性开角型青光眼小梁网TIMP2表达上调，有效抑制MMP2的表达，使MMP2降解ECM功能减弱，ECM异常过多堆积，小梁网通透性减弱，眼压升高。
　　
　　TIMP对MMP的抑制作用是通过TIMP与MMP的锌活性位点结合，抑制催化活性锌的表达而完成，主要分为两方面的调节：①MMP与TIMP的活性调节：MMP的活性调节主要分为基因调节、原酶激活及TIMP 三个阶段完成。各种MMP及TIMP亚型分别具有不同的调节机制。氩激光小梁成形术是原发性开角型青光眼的有效治疗方法之一。实验研究表明，激光作用于小梁网之后，MMP2、MMP3、MMP9表达均增强[9]。②MMP与TIMP的平衡调节：ECM的正常功能有赖于MMP与TIMP的平衡调节，所以MMP/TIMP比值与ECM降解关系更为密切。有研究表明，复发尿路上皮肿瘤患者的MMP2/TIMP2的比值明显高于无复发患者，这使MMP2/TIMP2比值成为预测复发的新标准[10]。TIMP2主要从以下两个方面抑制MMP2酶活性：①在酶原活化阶段可与proMMP2形成稳定的复合体，并阻碍其自我合成；②在活化的MMP2阶段可直接与活化的MMP2以1∶1比例非共价结合以抑制其活性，此种结合不稳定且可逆。
　　
　　本研究结果显示，MMP2的表达与青光眼病程呈负相关性(逐步下调)，TIMP2的表达与青光眼病程呈正相关性(逐步上调)；原发性开角型青光眼小梁网MMP/TIMP(mRNA)比值明显低于正常人，随青光眼病程的进展，MMP2/TIMP2比值逐步明显减小。本研究检测的22只正常人眼MMP2/TIMP2(mRNA)的比值范围为1.760～2.262，中期POAG患眼为0.496～0.582，晚期POAG患眼为0.238～0.316。本结果提示，POAG患眼TIMP2 mRNA表达量是MMP2 mRNA表达量的1倍左右为中期，当TIMP2 mRNA表达量达到MMP2 mRNA表达量的3～4倍时为晚期。但本研究检测的样本数量有限，在今后的工作中尚需扩大检测样本数进一步完善POAG 患眼MMP2/TIMP2(mRNA)的比值范围。MMP2/TIMP2系统的失衡极可能是原发性开角型青光眼的发病机制之一。MMP2/TIMP2比值可影响和预示青光眼的发病及病程发展，这很可能为原发性开角型青光眼的临床诊断、预测病程发展、评价疗效和预后提供检测依据。

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