葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立

　　 作者：李雅莉，张明，卢家美，刘昀，杨侠，孙秀珍

【摘要】 目的 建立葎草花粉粗浸液致敏激发的小鼠肺部变应性炎症模型。方法 24只BALB/c小鼠随机平均分为正常对照组和哮喘模型组。观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比;HE染色观察葎草花粉粗浸液激发小鼠肺部变态反应性炎症;酶联免疫吸附试验检测BALF、脾组织匀浆中的细胞因子及血清总IgE抗体。　结果 与正常对照组比较，模型组可诱导肺组织出现明显的变应性炎症，且病理炎症评分有统计学差异(P<0.01);BALF中的细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数、IL4，脾脏重量，脾组织匀浆IL4和血清总IgE抗体均显著高于正常对照组(P<0.01)。结论 葎草花粉粗浸液能够成功建立小鼠肺部变态反应性炎症模型。

【关键词】 葎草花粉粗浸液;哮喘;动物模型

　　ABSTRACT: Objective To develop a mouse model of allergic airway inflammation by using crude Humulus pollen extract.Methods　A total of 24 Balb/c mice were pided randomly into two groups: control group and asthma model group with 12 in each. After sensitization by intraperitoneal injection， the mice were challenged by intranasal instillation of crude Humulus pollen extract. The total cell number and eosinophile percentage of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples were determined. The lungs of mice were stained with hematoxylin and eosin to evaluate the degree of allergic inflammation. The cytokines in BALF and spleen homogenate were assayed by enzymelinked immunoassay (ELISA). The total IgE in the serum was also measured by ELISA.　Results Compared with the mice in normal control group， those in asthma group developed obvious allergic inflammation in the airways. Histological scoring for pulmonary inflammation significantly differed between normal group and asthma group (P<0.01).　The total cell number， eosinophile percentage and IL4 in BALF， spleen weight， IL4 in spleen homogenate， and IgE antibody in serum were all significantly increased in asthma group compared with those in normal group (P<0.01).Conclusion Crude Humulus pollen extract can successfully induce a mouse model of allergic pulmonary inflammation.

　　KEY WORDS: crude Humulus pollen extract; asthma; animal model

　　支气管哮喘是全球关注的公共健康问题，也是儿童与成人的常见病、多发病，其本质是气道变态反应性炎症。近年来其发病率和病死率不断升高[1]，不但严重威胁到人类的身心健康，而且还给家庭乃至社会带来严重的经济负担。引起人类支气管哮喘发病的变应原种类颇多，在不同国家、地区和季节的主要变应原差异较大。国内学者通过大量的临床调研表明，葎草花粉是我国夏秋季主要的致敏花粉之一[23]，常常引起哮喘急性发作，需要给予抗炎、平喘、解痉等治疗。但是，只有葎草花粉变应原疫苗的特异性免疫治疗才是唯一针对病因的治疗。鉴于人体试验的局限性和安全性，需开展葎草花粉变应原的研究，故制备葎草花粉过敏的哮喘小鼠模型显得尤为重要。在本研究中，我们采用葎草花粉粗浸液致敏和激发BALB/c小鼠，从而成功制备了葎草花粉过敏的小鼠肺部变应性炎症模型，旨在阐明葎草花粉诱导的肺部变应性炎症的病理与病理生理学特点，为研究支气管哮喘的发病机制与治疗方法提供新的手段。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及试剂 SPF级BALB/c小鼠24只，雌性，7周龄，体重(18±2)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。氢氧化铝凝胶由本实验室自制，RIPA裂解液购于西安沃尔森生物有限公司，小鼠白细胞介素(IL4)、γ干扰素(IFNγ)及IgE酶联免疫吸附反应检测(ELISA)试剂盒购于美国RD公司。

　　1.2 葎草花粉粗浸液的制备及其浓度测定

　　自然脱落法收集葎草花粉，9号分样筛过筛，室温下乙醚脱脂。取脱脂花粉5g加

　　Cocas液100mL，超声粉碎后4℃下搅拌提取72h，4℃下2800r/min离心15min，取上清。上清液以Cocas液透析24h，自然蒸发浓缩，之后除菌滤过并经考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量。以牛血清白蛋白制作标准曲线，取595nm处的吸光度值为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，得到标准曲线方程为Y=0.003+0.004X，根据标准曲线计算葎草花粉提取液蛋白质浓度为0.95mg/mL，最终调整葎草花粉提取液蛋白浓度为1mg/mL与10mg/mL，分别用于小鼠腹腔注射致敏和滴鼻激发。

　　1.3 动物分组 24只BALB/c小鼠随机分为正常对照组和模型组，每组12只;饲养于西安交通大学医学院SPF级动物房。

　　1.4 葎草花粉粗浸液诱导小鼠支气管哮喘模型的建立 模型组用1mL注射器腹腔注射300μg葎草花粉粗浸液加氢氧化铝凝胶

　　2mg致敏，对照组采用等体积的无菌PBS代替变应原进行实验。之后第7、14天后加强致敏，方法与剂量同上。第24天模型组所有小鼠给予30μL(10mg/mL) 葎草花粉粗浸液滴鼻激发，每天1次，连续5次;对照组采用等量无菌PBS代替变应原进行滴鼻，每天1次，连续5d。最后1次滴鼻后24h，进行以下检查。

　　1.5 血液的采集 从每只小鼠眼窝取血约0.8mL，室温放置2h，离心3000r/min 6min，血清移至另一干净Eppendorf管，-20℃保存。

　　1.6 脾组织匀浆的制备 处死小鼠，无菌条件下分离小鼠脾脏，称重后将脾组织切碎置入组织匀浆器进行手工研磨，之后再按1∶5的比例加入RIPA裂解液，在4℃的条件下裂解1h后，离心取上清液于-70℃的低温冰箱保存，用于测定细胞因子IL4和IFNγ。

　　1.7 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集及嗜酸性粒细胞计数 每组各取8只小鼠行通过气管插管术的支气管肺泡灌洗，分2次缓慢注入4℃冷PBS液，每次 0.5mL，缓慢收集，回收液为80%左右。BALF离心(1500r/min)6min，收集上清液-20℃保存，用于细胞因子的测定。细胞沉淀用0.5mL生理盐水重悬，并用血细胞计数板进行细胞计数，计算每毫升细胞数。取少许重悬液体涂片，室温晾干后Wright染色，光学显微镜下进行细胞分类，数200个细胞，求出嗜酸性细胞的百分比。

　　1.8 肺组织病理学检查 取各组未经支气管肺泡灌洗的4只小鼠的左肺组织，均用100mL/L甲醛溶液固定过夜。常规取材后制备HE染色切片，光镜下观察肺组织嗜酸性粒细胞浸润、水肿和气道上皮损伤情况，根据Underwood的标准[4]进行病理评分。

　　1.9 BALF和脾组织匀浆中的IFNγ和IL4含量的测定 IL4和IFNγ测定按ELISA试剂盒说明书进行。即每孔加入标准品稀释液或待测样品100μL，室温孵育2h，用洗涤液洗板5次;加入酶标抗体工作液100μL，室温孵育2h，洗涤液洗板5次;加入底物工作液100μL，置室温暗处反应30min;加入100μL终止液终止反应。分别在450nm读取吸光(A)值，然后绘制出A450nm对细胞因子浓度标准曲线，根据待测样品A450nm值，计算出标本中IL4与IFNγ的含量。

　　1.10 血清中总IgE的测定 小鼠血清用标本稀释液作1∶20稀释，之后按照ELISA试剂盒说明书逐步进行，测定血清中总IgE含量。

　　1.11 统计学处理

　　实验数据用均数±标准差(±s)表示，应用SPSS15.0软件对各组间的均数进行两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 动物的症状 模型组小鼠一般于激发3min后开始出现头、鼻、面部及躯干瘙痒，并有不同程度的烦躁不安或安静少动、呼吸加快加深、点头呼吸、弓背直立、前肢缩抬、二便失禁等哮喘速发相反应表现;而正常对照组小鼠活动自如，无上述表现。

　　2.2 BALF中细胞总数及其分类计数 我们通过对BALF进行细胞计数，结果表明，模型组小鼠BALF中白细胞总数为(44.91±2.03)×104/mL，显著高于对照组BALF中的白细胞总数(17.19±0.5)×104/mL;且模型组BALF中嗜酸性粒细胞分类计数(24±6.2)较对照组(0.53±0.26)亦显著升高(P<0.01)。

　　2.3 小鼠肺组织的病理学改变 模型组小鼠小支气管、血管黏膜下和周围肺组织均有明显的炎性细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)浸润，大量炎性细胞向小支气管和血管迁移，血管壁明显水肿，部分切片还可见上皮细胞脱落或管腔内有黏液栓形成。而对照组无明显变化，小鼠支气管黏膜上皮、黏膜肌层均完好，支气管管腔规则，周围无炎性细胞浸润(图1)。采用Underwood的标准进行病理炎症评分，发现模型组小鼠肺部的炎症浸润程度明显重于正常对照组(P<0.001)。

　　2.4 小鼠BALF中IL4和IFNγ的测定

　　小鼠经葎草花粉粗浸液致敏激发后，与正常对照组比较，模型组肺泡灌洗液中IL4含量显著升高，而IFNγ含量显著下降(P<0.01，表1)。表1 葎草花粉致敏小鼠BALF中IL4和IFNγ含量的变化

　　2.5 小鼠脾脏重量及脾组织匀浆中细胞因子的比较

　　取出脾脏后，统一称重，发现模型组脾脏的重量显著高于正常对照组(P<0.01)。通过ELISA法测定外周免疫器官脾脏组织匀浆上清液中的IL4和IFNγ含量。与正常对照组比较，模型组小鼠脾脏中IL4含量组明显升高，IFNγ的含量显著降低(P<0.01，表2)。表2 葎草花粉致敏的小鼠脾脏重量及其匀浆中IL4和IFNγ含量的比较

　　2.6 小鼠血清中总IgE含量的测定 ELISA法测定葎草花粉致敏的小鼠血清中总IgE含量为(3.15±0.99)μg/mL，而对照组小鼠血清中总IgE含量为(0.42±0.07)μg/mL，两组之间有显著的统计学差异(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，并伴有气道高反应性、可逆性气流受限、黏液高分泌和血清IgE的升高，晚期可出现气道重塑[5]。鉴于人体试验研究的安全性，动物模型是研究人类哮喘不可缺少的手段之一。目前，已成功构建了多种变应原炎症的动物模型，如卵蛋白[6]、尘螨[7]、蟑螂[8]、豚草花粉[9]等，而没有一个动物模型能够完全模拟人类支气管哮喘的发作过程[10]。利用这些已存在的动物哮喘模型，不但很好地研究支气管哮喘的发病机制，而且也为开展变应原研究提供了一个重要手段。但是，目前尚未见葎草花粉变应原致敏的哮喘动物模型报道。

　　葎草花粉是我国最主要的吸入性变应原之一[23]，并且患者逐年增多。目前，国内外文献对小鼠致敏和激发的方式也有着诸多报道。例如，采用腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、鼻内滴入等方法致敏;而激发的方式则主要集中在鼻内滴入和雾化吸入两种激发方式上。在本研究中，我们通过第0天腹腔注射，第7、14天加强致敏，之后连续5d滴鼻激发，结果发现葎草花粉粗浸液变应原能够成功诱导小鼠肺部变应性炎症，表现为小气道和血管周围出现大量炎症细胞，并可见许多嗜酸性粒细胞浸润;而对照组小鼠小气道和血管周围并无炎性细胞渗出。BALF中亦存在大量炎性细胞，也以嗜酸性粒细胞为主。研究结果证实了我们成功构建了葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型，其病理变化和人类变应性哮喘的病理特征基本相似。

　　变应性哮喘的主要免疫学改变是Th1/Th3细胞比例和功能失衡[11]，其分泌的细胞因子在支气管哮喘中起着重要的作用。Th3分泌的特征性细胞因子IL4，刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成Th3细胞，使IgE及IgG1合成增多，募集嗜酸性粒细胞向小气道浸润，因而在支气管哮喘的起病和进展中起着重要的作用;而IFNγ为Th1型细胞因子，能够抑制Th3型细胞因子的作用，对支气管哮喘起保护作用[12]。在本实验中，我们发现模型组小鼠脾脏重量显著高于正常对照组，间接说明模型组小鼠的外周免疫器官发生了强烈的免疫反应;且模型组小鼠BALF和脾组织匀浆中IL4显著升高、血清IgE增加、IFNγ降低，表明葎草花粉粗浸液致敏激发诱导了小鼠Th3型免疫反应。

　　国内外许多学者[13]通过腹腔注射致敏和雾化吸入激发的方法成功建立了哮喘动物模型，更加真实地模拟了人类哮喘的发病过程。但是，由于葎草花粉粗浸液的制备较为复杂，采用滴鼻激发的方法不但成功制备了葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型，而且还减少了葎草花粉粗浸液用量。另外，由于实验室条件的局限性，本实验仅观察了气道和肺部炎症的病理学改变及与支气管哮喘相关的特异性细胞因子的改变，尚未观察此模型的气道反应性变化，有待后续实验的进一步完善。进一步完善此模型也将为开展葎草花粉变应原DNA疫苗、重组葎草花粉变应原及变应性哮喘的研究奠定坚实的基础。

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