癸酸钠对盐酸小檗碱在小肠各段促吸收作用的研究

　　　　 作者：吕晓艳 白彩艳1 陈加俊 王云晶 孟昭杰 李鸥 王春艳 陈立 何淑梅

【摘要】 目的 研究癸酸钠(Sodium caprate，SC)对盐酸小檗碱(Berberine，Ber)在大鼠肠道吸收的促进作用及有效作用部位。方法 采用外翻肠囊法，分肠段观察了SC对小肠吸收的促进效果，并根据计算的表观渗透系数(apparent permeability coefficients，Papp)和增渗比(Enhancement Ratio，ER)，比较癸酸钠对不同肠段Ber吸收的促进作用。结果 Ber在小肠各段均有不同程度的吸收;SC在十二指肠、空肠、回肠段均可促进Ber的吸收(P&<0.05或P&<0.01)，回肠黏膜对吸收促进剂SC有较高的敏感度，促渗强弱顺序为：回肠&>十二指肠&>空肠;SC组各肠段Papp均有不同程度的升高(P&<0.05或P&<0.01)，增渗比ER分别为2.08、1.49、3.49。结论 SC在十二指肠、空肠、回肠段均可显著促进Ber的吸收，其在小肠的促吸收最佳部位是回肠。

【关键词】 盐酸小檗碱;外翻肠囊法;癸酸钠;肠道吸收

　近年来发现盐酸小檗碱(Ber)具有广泛的药理作用，对糖尿病、高血脂、高血压及心血管疾病均有很好的疗效，但Ber最根本的问题是其生物利用度很低，在5%左右，大大限制了其临床应用〔1～3〕。目前国内外多关注于Ber新药理作用的研究，但其肠道吸收动力学资料较为匮乏。课题组前期工作将肠吸收促进剂癸酸钠(SC)与Ber合用，通过在体肠灌流法观察SC对Ber肠道吸收的影响，结果显示SC对盐酸小檗碱有显著的促吸收效果。本实验将采用离体外翻肠囊法，进一步研究SC对盐酸小檗碱的促吸收作用，并明确SC促Ber吸收的有效部位，为指导探索和开发较易吸收的口服新型Ber制剂提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品、试剂与仪器 Ber原料药(东北制药总厂);Ber标准品(中国生物检定所);SC(Sigma公司);乌拉坦(中国医药集团上海试剂公司)。一次性微孔滤膜过滤器(水系);API4000型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源以及Analyst 1.3数据处理软件(美国Applied Biosystem公司)，三用恒温水箱(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

　　1.2 动物分组及给药 雄性Wistar大鼠10只，体重(250±30)g，购自吉林大学实验动物中心，合格证号：20030001。随机分为2组：Ber组(Ber 50 μmol/L)，Ber+SC组(Ber 50 μmol/L+0.2%SC)，每组5只。

　　1.3 质谱法测定样品中Ber的含量

　　1.3.1 质谱条件 API4000型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源以及Analyst 1.3 数据处理软件，美国Applied Biosystem公司;离子源：离子喷雾离子化源;离子喷射电压：2 500 V;温度：500℃ ;源内气体1(GS1，N2)压力：50 psi;气体2(GS2，N2)压力：50 psi;气帘气体(N2)压力：15 psi;正离子方式检测;扫描方式为多重反应监测 (MRM);Ber的解簇电压(DP)为：70 V;碰撞能量(CE)为：56 eV;用于定量分析的离子反应为m/z 336.1→ m/z 278.1。

　　1.3.2 标准曲线的制备 将Ber标准品用PBS溶液配制成浓度分别为：0.3，1，3，10，30，100，300，500 ng/ml，在上述色谱条件下测定，以峰面积y对浓度x进行线性回归，绘制标准曲线。

　　1.3.3 肠循环液中Ber浓度的测定 精确吸取大鼠在体肠循环液样品，按上述质谱条件进样测定，计算Ber浓度。

　　1.4 分肠段外翻肠囊法〔4〕 以50 μmol/L的Ber PBS溶液为供试液。禁食16 h的大鼠腹腔注射20%乌拉坦溶液麻醉后，沿腹中线开腹后，在十二指肠上端和回肠下端(盲肠上5 cm)处各开一个小口，用50 ml注射器抽取37℃生理盐水，自开口处冲洗肠管，取十二指肠(幽门下1 cm为起始点)、空肠上段 (以幽门下15 cm为起始点)，回肠(以盲肠上20 cm为起始点)各8 cm，迅速移入持续通气的冰冷的PBS液中。用滤纸吸干肠段浆膜面水分，一端结扎后用细玻璃棒将肠段轻柔向外翻转，使黏膜面朝外，浆膜面朝内。另一端插一长2 cm的细玻璃管，用加样器注入2 ml的PBS液体，迅速悬于盛有35 ml Ber 50 μmol/L加或不加0.2% SC供试液的大试管中，向试管中持续通入95% O2和5% CO2。整个装置放在37℃恒温水浴中，于15、30、60、90 min取肠囊内液体1ml，同时补充相同体积的不含药PBS。在每次实验后测量肠囊表面积。采用质谱法测定样品中Ber的浓度。

　　1.5 数据分析 各肠段Ber表观渗透系数〔5〕(Papp)的计算：Papp=〔V/(Area ·C0)〕·dC/dt，其中V 是肠囊内液体体积，Area是肠囊的表面积，C0是囊外盐酸小檗碱的初始浓度，dC/dt是囊内Ber浓度对时间的变化率，可由囊内Ber的浓度与时间直线回归求得。用增渗比(ER)来比较SC对不同肠段Ber吸收的促进作用：ER=P/P0，P和P0分别是加与不加促进剂后Ber在肠囊的表观渗透系数。采用SPSS软件进行数据统计学分析。

　　2 结 果

　　2.1 LCMS法检测Ber的浓度 由于本实验供试液中Ber的浓度极低，需要较高灵敏度的测量方法才能保证实验的准确性，HPLC的方法已经不能满足本实验要求，因此我们采用灵敏度更高的LCMS法检测供试液中Ber的浓度，质谱图见图1。利用Ber标准品绘制标准曲线为：y=1.92e4x±1.98e3，r2=0.999 4，可见在此范围内线性关系良好。

　　2.2 SC对Ber在各肠段吸收的影响 在肠外翻模型中，Ber从黏膜面向浆膜面吸收的情况如表1及图2所示，随着孵育时间的延长，透过肠壁药物量逐渐增加，其中以十二指肠、空肠段吸收较好，回肠段吸收较差，但各肠段间无统计学差异(P&>0.05)，表明Ber在各小肠段均有一定量吸收，无特定吸收部位。加入SC后孵育30 min时，盐酸小檗碱在回肠段的吸收明显增加(P&<0.05);孵育60 min时，十二指肠Ber吸收增多，与对照组相比有统计学差异(P&<0.05);孵育90 min时，SC可显著促进各肠段Ber的吸收(P&<0.05或P&<0.01)，其中以回肠段作用效果最为明显，见图2。A PBS加Ber标准品(3 ng/ml) B 在体肠循环液样品图1 LCMS质谱图表1 SC对Ber经离体肠段渗透的影响按1.5中的公式求出Ber在大鼠各肠段的表观通透系数Papp，结果见表2。盐酸小檗碱在十二指肠、空肠、回肠段Papp以空肠较高，但各组间无统计学差异。加入SC后，十二指肠、空肠、回肠段Ber的Papp均有不同程度的升高(P&<0.05或P&<0.01)。增渗比ER分别为2.08、1.49、3.49，可见在回肠段SC对Ber促吸收作用最为显著，不加促进剂的回肠段的 Papp为2.82×10-7cm/s，加入SC后 Papp为9.85×10-7 cm/s，渗透系数提高了3.49倍。表2 SC对Ber在大鼠各肠段的Papp的影响图2 90 min时SC对Ber经各小肠段渗透的影响

　　3 讨 论

　　Ber是一种传统中药，具有广泛的药理作用，对心律失常、高血压、充血性心力衰竭、糖尿病、高血脂等均有治疗作用，因此对Ber新用途的开发有较大的发展空间。但Ber肠道吸收很差，潘国宇等〔6〕采用在体肠灌流模型观察Ber的吸收特性，在肠灌流实验中，Ber很难从肠道被大鼠吸收，而且吸收过程个体差异大。吸收过程主要发生在给药1 h之后。2.5 h之后，仅有约5%的Ber从肠道消失。因此如何改善Ber在肠道的吸收，降低其临床用量从而避免其副作用成为目前需解决的问题。

　　SC(SC)是唯一批准可以在商品中使用的脂肪酸盐类促吸收剂，其促吸收机制主要是与膜结合，使膜的结构紊乱，同时与细胞间紧密连接处的各种离子产生螯合作用，导致肌动蛋白微丝收缩而暂时打开上皮紧密连接，增加旁细胞转运〔3〕。SC作为一种肠道促吸收剂，已在瑞典、丹麦和日本的氨苄西林(axlium ampicillin)栓剂中应用〔2〕，在体外渗透试验中，SC可使依比拉肽的空肠渗透速率提高1.5倍，结肠提高3.84 倍〔7〕;在以SC作吸收促进剂的氨苄西林栓剂生物利用度试验中，Cmax、AUC 分别比未加促吸收剂的栓剂增加2.6 倍和2.3倍〔8〕。刘辉等〔9〕用五种促吸收剂观察其对胰岛素肠道吸收的影响。结果显示SC可显著提高胰岛素在肠道内的吸收水平，并且提出结肠是SC促进胰岛素肠道吸收的最佳位置。沈腾等〔10〕以体外透肠实验比较了5种吸收促吸收剂对低分子量肝素(LMWH)经不同肠段渗透的影响，结果显示SC可显著促进十二指肠段和结肠段LMWH的吸收，结肠部位的增渗比高于十二指肠，但LMWH渗透系数和累积渗透浓度仍以十二指肠更高，表明促吸收剂作用的敏感部位有时并非是药物吸收的最佳部位。杨振华〔11〕对含不同直肠吸收促进剂的氯唑西林钠(Cloxacillin Sodium，Cloxa)栓剂进行了溶出度试验及兔血药浓度测定。结果显示，SC对氯唑西林钠有显著的促进直肠吸收效果。可见，SC是一种安全而高效的肠道促吸收剂。

　　外翻肠囊法即翻转动物离体肠段，使黏膜朝外浆膜朝内。肠一端节扎或两端结扎，悬挂于含药供试液中，充分供氧，定时取样。此法为离体实验，可研究肠道不同区段对药物的排泄和吸收情况，可控性强。考虑到肠道组织活性，实验时间不宜过长。因此尽量缩短手术及实验时间，手术时间控制在3 min之内，实验时间为90 min。

　　在肠外翻模型中，我们最初拟考察SC对Ber在十二指肠、空肠、回肠及结肠段吸收的影响，而结果显示在结肠段Ber几乎不吸收(质谱法检测不出)，因此实验结果中只展示了十二指肠、空肠及回肠的吸收情况。对加入SC组与Ber对照组比较进行双侧t检验，结果显示孵育30 min时，回肠段已有明显促吸收作用。孵育90 min时，SC在十二指肠、空肠、回肠段均显示出显著的促吸收作用，且各肠段Ber的渗透系数都有不同程度的提高，增渗比ER分别为2.08、1.49、3.49。Ber单用组吸收量空肠&>十二指肠&>回肠段，以回肠吸收最差，加入SC组90 min时，Ber吸收量为回肠&>十二指肠&>空肠段，可见在回肠段SC对Ber促吸收作用最为显著。

　　本实验结果显示，SC在各小肠段对Ber均显示出良好的促吸收效果，将为指导探索开发较易吸收的口服新型Ber制剂提供理论依据。

参考文献

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　　3 Coyne CB，Kelly MM，Boucher RC，et al.Enhanced epithelial gene transfer by modulation of tight junctions with sodium caprate〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2000;23：6029.

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　　6 潘国宇，王广基，孙建国.小檗碱对葡萄糖吸收的抑制作用〔J〕.药学学报，2003;8(12)：9114.

　　7 Yamamoto A，Okagawa T，Kotani A，et al.Effects of different absorption enhancers on the permeation of ebiratide，an ACTH analog，across intestinal membranes〔J〕.J Pharm Pharmacol，1997;49(11):105761.

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　　9 刘 辉，潘卫三.五种吸收促进剂对胰岛素肠道吸收的影响〔J〕.中国药学杂志，2004;39(4)：2768.

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　　11 杨振华，偶志红.不同吸收促进剂对氯唑西林钠栓溶出度和家兔血药浓度的比较〔J〕.中国医院药学杂志，1998;18(1)：58.