塞来昔布对人淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡及存活素表达的影响

　　　　 作者：范红 程远东 孙哲 吕晓东

【摘要】 目的 观察选择性COX2抑制剂塞米昔布(Celecoxib)对Raji细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测存活素(Survivin)在细胞中的表达情况。方法 应用流式细胞术(FCM)分析Celecoxib对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞周期的影响并检测细胞凋亡及存活素在细胞中的表达情况，应用RTPCR法检测细胞中Survivin mRNA的表达水平。结果 Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后吸光度值与对照组相比均有显著性差异(P&<0.05)，同时各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异(P&<0.05)。Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞48 h后各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率和细胞周期的影响、下调Survivin蛋白表达下调Survivin mRNA相对表达量具有显著性差异(P&<0.05)。结论 Celecoxib能够通过诱导凋亡抑制Raji细胞的增殖，其机制可能与抑制Survivin表达有关。

【关键词】 Celecoxib;淋巴瘤;细胞周期;凋亡;Survivin

　选择性COX2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)是近年来用于临床的新型非甾体类抗炎药，其药理作用特点是选择性作用于COX2，能使许多肿瘤细胞的增殖受到抑制，但具体机制仍未完全清楚。Survivin作为一种多肿瘤抑制基因在肿瘤细胞的凋亡过程中起调控作用。目前国内外有关Survivin表达与Celecoxib诱导淋巴瘤细胞凋亡之间关系的研究尚处于空白。本实验通过体外培养人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞，观察选择性COX2抑制剂Celecoxib对Raji细胞生长增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测凋亡抑制因子Survivin在细胞中的表达情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 Burkitt′s淋巴瘤细胞株Raji由郑州大学基础医学院提供，常规培养于含10%的灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养，2～3 d传代1次。台盼蓝排斥实验检测细胞拒染率均在95%以上。实验分为对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的DMSO。(预实验显示终浓度0.1%的DMSO在实验中对Raji细胞生长没有明显影响);实验组:细胞培养基中加入DMSO溶解的Celecoxib(南京德宝生化器材有限公司)，终浓度分别为12.5、50、100、150 μmol/L〔1〕。

　　1.2 MTT法检测Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔细胞培养板中，每孔100 μl(1×104个细胞/孔)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育24、48、72 h，孵育结束前4 h，各培养孔加入MTT(Merke公司)(5 mg/ml)10 μl，1 500 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入DMSO 100 μl。 震荡15 min溶解结晶，全自动酶标仪测出每孔吸光度值(A492值)，计算细胞抑制率。

　　1.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和周期分布 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×106/ml，接种于24孔细胞培养板中，每孔1 ml(1×106个细胞吼)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育48 h后离心收集细胞，并用70%乙醇固定，4℃过夜后再经PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)1 ml，4℃避光30 min，用Beckman Coulter公司提供的流式细胞仪标准程序进行分析。

　　1.4 FCM检测Raji细胞中Survivin蛋白表达 收集细胞，去除样品中的70%乙醇，用PBS离心洗涤2次，加入Survivin鼠抗人单克隆抗体一抗(Santa公司)工作液100 μl，工作浓度1∶100(克隆系FL142)。室温孵育30 min，PBS10 ml洗涤1次，弃上清。加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100 μl，室温孵育30 min，PBS 10 ml离心同上，弃上清，加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上流式细胞仪检测。

　　1.5 RTPCR法检测Raji细胞中Survivin基因表达水平

　　1.5.1 细胞总RNA提取:Trizol试剂盒提取RNA。

　　1.5.2 RTPCR (1)引物设计:Survivin、βactin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Survivin:上游引物5′GCATGGGTGCCCCGACGTG3′，下游引物5′GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA3′，扩增片段长度为447 bp;βactin:上游引物5′GGCGGCACCACCATGTACCC3′，下游引物5′AGGGGCCGGACTCGTCATAC3′，扩增片段长度为202 bp。 (2)总反应体积30 μl:含无菌双蒸水19.3 μl，MgCl22 μl，20× buffer 1.5 μl，上游、下游引物各1 μl，RNA模板2 μl，dNTP 1.2 μl，RTPCR酶混合物2 μl。预变性94℃，2 min;变性94℃，1 min。退火55℃，50 s。延伸72℃，50 s，共35个循环，72℃再延伸10 min，凝胶成像，GelPro Analyzer 3.1软件进行半定量分析。

　　1.6 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，所有数据采用x±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用 Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后，对细胞生长均有抑制作用，吸光度与相应对照组相比均有显著性差异(P&<0.05)，各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异(P&<0.05)，说明不同浓度Celecoxib均有抑制Raji细胞增殖作用，此作用呈时间、剂量依赖性。Celecoxib各浓度组作用Raji细胞48 h后出现明显的凋亡峰，各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率的影响差异明显(P&<0.05)，说明随着Celecoxib浓度增加，可引起Raji细胞凋亡率逐渐增大，即凋亡的细胞数量与Celecoxib呈量效关系，见表1。表1 Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用

　　2.2 Celecoxib对Raji细胞周期分布的影响 各浓度组Celecoxib作用Raji细胞48 h后，随药物浓度增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加，S期及G2/M期细胞比例逐渐减少。Celecoxib可阻滞Raji细胞于GO/G1期，且随着Celecoxib浓度的增加，阻滞作用增强，呈一定剂量依赖关系(P&<0.05)，见表2。表2 Celecoxib对Raji细胞周期分布的影响　　2.3 Celecoxib对Raji细胞Survivin蛋白和Survivin mRNA表达水平的影响 Celecoxib各浓度组作用Raji细胞48 h后，随着Celecoxib浓度的增加，Raji细胞中Survivin蛋白的表达率逐渐减低，呈一定剂量依赖关系。Celecoxib不同浓度组间下调Survivin蛋白表达也具有显著意义(P&<0.05)(表3)。Raji细胞中Survivin mRNA 的相对表达量逐渐减低，呈一定剂量依赖关系。Celecoxib不同浓度组间下调Survivin mRNA表达具有统计学意义(P&<0.05)，见图1。1：Celecoxib 150 μmol/L，2：Celecoxib 100 μmol/L，3：Celecoxib 50 μmol/L，4：Celecoxib 12.5 μmol/L，5：Celecoxib 0 μmol/L， M：Marker　图1 不同浓度对Celecoxib对Raji细胞Survivin mRNA和βactin mRNA表达的影响表3 Celecoxib对Raji细胞Survivin蛋白和Survivin mRNA表达的影响

　　3 讨 论

　　本实验显示Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后吸光度值与对照组相比均有显著性差异，同时各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异。Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞48 h后各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率和细胞周期的影响、下调Survivin蛋白表达Fl和下调Survivin mRNA相对表达量具有显著性差异，提示Celecoxib可能通过诱导凋亡抑制Raji细胞的增殖，其机制可能与抑制Survivin表达有关。

　　选择性COX2抑制剂能使许多肿瘤的增殖受到抑制，但其作用机制目前仍未完全清楚。已有研究发现，选择性COX2抑制剂可通过COX2依赖性途径和非COX2依赖性途径诱导细胞的凋亡〔2〕。COX2依赖性途径主要包括抑制COX2减少前列腺素合成，从而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成;抑制肿瘤浸润和转移〔3〕等。本研究结果显示，选择性COX2抑制剂Celecoxib对人恶性淋巴瘤细胞株Raji的增殖具有明显的抑制作用，这种抑制作用表现有良好的时间依赖性和剂量依赖性。随着时间及Celecoxib浓度的增加，细胞生长抑制率呈递增趋势，150 μmol/L浓度作用72 h达到最高为93.87%。这与Wun等〔4〕的研究结果相符。

　　细胞周期受细胞周期调控系统控制，细胞周期调控系统由细胞周期素(cyclin)、细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(CKI)三大类蛋白家族所组成。有研究发现COX2选择性抑制剂通过改变细胞周期调控蛋白的表达，诱导多种肿瘤细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞的增殖，其机制可能为非COX2依赖性途径〔5〕。本研究结果显示Celecoxib通过细胞周期阻滞对Raji细胞产生增殖抑制作用，其阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制其向S期转变。这与Grosh研究发现celecoxib阻滞结肠癌细胞周期结果一致〔6〕。但其是如何通过改变细胞周期调控蛋白的表达发挥作用，尚有待进一步深入探讨。

　　Survivin是1997年发现的凋亡蛋白抑制剂(inhibitibor of apoptosis protein，IAP)家族中的成员之一，其选择性表达于各种肿瘤组织。Survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能， Caspase是细胞凋亡的核心机制，其级联反应的激活决定了凋亡形态的变化。Survivin直接作用于Caspase，主要抑制Caspase3，Caspase7的活性，阻断细胞的凋亡过程〔7〕。本实验通过对Survivin蛋白的检测中发现，各处理组作用Raji细胞48 h后Survivin蛋白表达量与对照组相比，12.5 μmol/L Celecoxib组与对照组间无显著性差异(P&>0.05)，考虑可能是检测的样本量较少造成的;其余Celecoxib浓度组与对照组间差异均具有显著性(P&<0.05)。此外，检测Survivin mRNA表达与对照组相比，差异均具有显著意义(P&<0.05).Celecoxib不同浓度组间下调Survivin蛋白和Survivin mRNA表达具有显著性差异(P&<0.05)。由此证实，Celecoxib干预后，凋亡抑制基因Survivin表达水平显著下调，由此打破了促凋亡基因与抗凋亡基因表达之间的平衡关系，促使Raji细胞朝着细胞凋亡的方向发展。 Catalano等〔8〕对恶性间皮瘤的研究表明，Celecoxib可以呈剂量依赖性和时间依赖性方式诱导间皮瘤细胞的凋亡，其机制为降低Akt的磷酸化，降低Bcl2和Survivin蛋白的表达，并抑制caspase3的激活。本实验结果与之一致。本文研究结果为Celecoxib 应用于临床防治恶性淋巴瘤提供了实验和理论依据，但其具体作用机制及其体内效应有待进一步探讨。

参考文献

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　　3 Basu GD，Pathangey LB，Tinder TL，et al.Mechanisms underlying the growth inhibitory effects of the cyclooxygenase2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cells〔J〕.Breast Cancer Res，2002;7：R422235.

　　4 Wun T，McKnight H，Tuscano JM.Increased cyclooxygenase2(COX2)：a potential role in the pathogenesis of lymphoma〔J〕.Leuk Res，2004;28： 17990.

　　5 Cheng J，Imanishi H，Liu W，et al.Involvement of cell cycle regulatory proteins and MAP kinase signaling pathway in growth inhibition and cell cycle arrest by a selective cyclooxygenase2 inhibitor，etodolac，in human hepatocellular carcinoma cell lines〔J〕.Cancer Sci，2004;95： 66673.

　　6 Grosch S，Tegeder I，Niederberger E，et al.COX2 independent induction of cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells by the selective COX2 inhibitor celecoxib〔J〕.FASEB J，2001;15：274244.

　　7 Sung BJ，Cho YS，Kim HJ，et al.An anti apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of Caspase 3 and 7〔J〕.Biochemistry，2001;40： 111720.

　　8 Catalano A，Graciotti L，Rinaldi L，et al.Preclinical evaluation of the nonsteroidal antiinflammatory agent celecoxib on malignant mesothelioma chemoprevention〔J〕.Int J Cancer，2004;109：32232.