降钙素基因相关肽衍生物的优化表达及纯化

　　　　 作者：肖莉杰 林平 陈文 姜颖 刘紫君 于晓光

【摘要】 目的 优化重组降钙素基因相关肽衍生物(CGRPVY)蛋白的表达体系，并利用亲和层析获得高纯度的重组蛋白。方法 在前期研究的基础上，将构建的pET32a(+)rhCGRPVY在大肠埃希菌中表达，分别对时间、温度和IPTG的浓度进行优化。采用NiNTA亲和层析柱分离纯化可溶性蛋白，YLN凝胶影像分析系统和Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量。结果 重组蛋白的最佳表达条件为诱导时间4 h、诱导温度37℃、IPTG浓度0.75 mmol/L，重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%，高效表达的CGRPVY融合蛋白大部分可溶，纯化后蛋白纯度可达90%以上，蛋白浓度约为0.09 mg/ml。结论 成功优化了蛋白表达条件，并用亲和层析法纯化出大量可溶性TrxArhCGRPVY。

【关键词】 降钙素基因相关肽衍生物;VY;优化;纯化

　　【Abstract】 Objective To optimize the expression level of engineering strain of calcitonin generelated peptide derivant(CGRPVY)， then use affinity chromatograph to obtain recombinant protein of high purity. Methods Based on the groundwork of former research， an expression vector pET32a(+)rhCGRPVY which was constructed by this group was used to express TrxArhCGRPVY in E coli. Expression of TrxArhCGRPVY was optimized on the induction time， temperature， and the concentration of IPTG respectively. The soluble fusion protein was purified by NiNTA chromatography column and its purity and content were detected by YLN2000 gel image analysis and Bradford assay. Results The optimized expression condition of TrxArhCGRPVY was obtained which was 4 h of induction， 37℃ of incubation， 1.0 mmol/L IPTG of final concentration. Expression conditions was optimized， the maximum yield of fusion protein was about 70% ～ 80% of the total mass of bacterial proteins. The purity reached at least 90% and about 0.09 mg/ml protein was acquired. Conclusions To optimize the expression condition of TrxArhCGRPVY in E coli successfully and obtain soluble TrxArhCGRPVY by affinity chromatograph.

　　【Key words】 CGRPVY ;VY;Optimization;Purification

　　降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide alpha，CGRP)是迄今所知体内较强的扩张血管的多肽成分，具有舒张血管、降低血压等生理功能，同时兼有治疗心衰和增强心输出量的作用。降血压肽(Angiotensinconverting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)是一类能够降低人体血压的小分子多肽的总称，是血管紧张素转化酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的〔1〕。其突出优点是对高血压患者具有降血压作用，而对血压正常的人无降压作用，降压作用持久、无副作用〔2，3〕。二肽VY(ValTyr)是从清酒中提取的降血压肽，在体内具有降血压功能〔4〕，且无毒副作用。本室已成功构建CGRP衍生物(CGRPVY)的基因工程菌株，并进行了体外表达及粗提物对蟾蜍肠系膜微循环的扩血管活性检测，证实CGRPVY菌株粗提物具有扩血管活性，且活性高于CGRP的菌株粗提物〔5〕。本研究进一步探索重组质粒pET32a(+)CGRPVY在大肠埃希菌中的表达特点，以获得可溶性重组CGRPVY 融合蛋白(TrxA recombinant human CGRPVY 即：TrxArhCGRPVY )的最佳表达和纯化条件，以期纯化出大量的TrxA rhCGRPVY，为以CGRPVY为主要成分的降血压药物的开发性研究做必要的实验准备。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 菌株和质粒：大肠埃希菌BL21trxB(DE3)pLysS和pET32a(+)质粒载体为Novagen公司产品。重组菌株pET32a(+)CGRPVY由哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室保存。主要试剂：异丙基βD硫代半乳糖苷酶(IPTG)等购自Promega公司，BugBuster NiNTA His.Bind 纯化试剂盒为Novagen公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 可溶性TrxArhCGRPVY的诱导表达及条件优化 按照单因子顺序进行，每项优化结果用于后续实验。首先挑选鉴定正确的单菌落接入牛肉膏蛋白胨(LB)培养基中过夜培养，获得的菌液按照2%接种量接入含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养基，用作培养条件的研究。

　　1.2.1.1 诱导时间对表达产量的影响 LB培养基接种液在37℃继续培养至OD600=0.6～0.8，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，37 ℃诱导培养1、2、3、4、 5、6 h，收获细菌，15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析。

　　1.2.1.2 温度对表达产量的影响 LB培养基接种液在37℃继续培养至OD600=0.6 ～ 0.8，按照已经优化的诱导时间，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，在45℃、40℃、37℃、32℃、27℃不同条件诱导培养，收获菌体，15% SDSPAGE分析。

　　1.2.1.3 IPTG浓度对表达产量的影响 LB培养基接种液在已经优化的诱导温度下继续培养至OD600=0.6～0.8，加入终浓度为 0.25 mmol/L、 0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L IPTG，按照已经优化的诱导温度诱导培养，诱导时间按照上步优化结果，收获细菌，15% SDSPAGE分析。

　　1.2.2 可溶性TrxArhCGRPVY的纯化 按上一步找出的最佳表达条件，用100 ml含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB 液体培养基增菌后，收集菌体利用BugBuster NiNTA His.Bind 纯化试剂盒中提供的裂解液裂解菌体，离心后分别将上清和沉淀进行15%SDSPAGE电泳检测。由于表达蛋白的N端融合了6个组氨酸，故可将菌体裂解液上清用NiNTA琼脂糖树脂亲和层析进行纯化(具体方法参照其说明书)，纯化后，15% SDSPAGE电泳检测，采用考马斯亮蓝(Bradford)法经核酸蛋白检测仪进行蛋白浓度测定。

　　2 结 果

　　2.1 可溶性TrxA rhCGRPVY诱导表达条件的优化

　　2.1.1 诱导时间对表达量的影响 随诱导时间的延长TrxArhCGRPVY的表达量升高，但增加诱导时间表达量增高不明显，因此，IPTG的适宜诱导时间为4 h。见图1。图1 诱导时间对蛋白表达量的影响

　　2.1.2 诱导温度对表达量的影响 在37℃诱导时TrxArhCGRPVY的表达量最高，高于或低于37℃表达量均下降。见图2。

　　2.1.3 诱导剂IPTG浓度的影响 随诱导剂IPTG浓度的升高，蛋白表达量增加，但浓度高于0.75 mmol/L时表达量增加不明显，因此，可选0.75 mmol/L的IPTG浓度作为最佳诱导剂浓度。见图3。

　　2.2 可溶性TrxA rhCGRPVY的纯化 融合蛋白TrxA rhCGRPVY主要以可溶性形式存在于菌体裂解液的上清中，经NiNTA琼脂糖柱亲和层析纯化后的洗脱液有一条清晰的约为21.2 kD的特异带;经光度扫描分析，TrxA rhCGRPVY蛋白占细菌总蛋白的30%，纯化后蛋白纯度可达90%以上，蛋白浓度约为0.09 mg/ml。见图4。图2 诱导温度对蛋白表达量的影响泳道1，2，3，4，5的IPTG诱导浓度分别为0.25 mmol/L，0.50 mmol/L，0.75 mmol/L，1.0 mmol/L，1.5 mmol/L图3 IPTG浓度对蛋白表达量的影响泳道1：未被IPTG诱导;泳道2～6：重组菌诱导条件均为37℃、IPTG 诱导4 h，3：上清，2，4：沉淀，5，6：层析洗脱液图4 表达产物的SDSPAGE

　　3 讨 论

　　CGRP是由Amara和Rosenfold等于1982年发现的37肽〔6〕，因其具有较强的舒张血管、降低血压、激动心肌和抑制血管平滑肌增殖等作用〔7〕，与心血管疾病、特别是高血压密切相关。CGRP不仅参与疾病的发生与发展，更可以作为抗高血压物质，具有潜在的临床应用价值。1994年，Saito等人从清酒中分离得到二肽VY，并通过口服给药途径，使得自发性高血压大鼠血压显著下降〔8〕。VY是由缬氨酸酪氨酸组成的二肽，目前大多是从沙丁鱼中提取此种活性短肽的混合品加以使用〔9〕，但提取过程繁琐，耗时较长，不适于大规模生产〔10〕。为了获得降压活性更强的多肽，将VY与CGRP耦联，耦联后不会因肽链太长改变蛋白分子空间构型而影响生物活性。相反，由于降血压肽VY可以抵抗蛋白酶的降解，在体内降压作用持久，因此耦联了VY的CGRP(CGRPVY)，降压幅度有所提高，而副作用没有增加。

　　在构建pET32a(+)rhCGRPVY重组质粒与初步表达及纯化的基础上，本文通过设立培养温度、培养时间及IPTG浓度的梯度实验，成功的摸索出了可溶性的TrxArhCGRPVY最佳表达条件。本研究发现：培养温度、诱导时间及IPTG浓度对可溶性的TrxA rhCGRPVY表达有很大的影响。结果表明，诱导温度37℃、IPTG浓度0.75 mmol/L和诱导4 h是可溶性TrxA rhCGRPVY的较佳表达条件，经亲和层析可获得高纯度的融合蛋白。本研究为以rhCGRP为主要成分的降血压药物的开发性研究工作奠定了实验基础。

参考文献

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　　7 Brain SD，Wllians TJ，Tippins JR，et al.Calcitonin generelated peptide is a potent vasodilator〔J〕.Nature，1985;313(3):546.

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　　10 曹文红，章超桦.食品蛋白降血压肽及其酶法制备〔J〕.食品科技，2002;(4)：910.