作者：苑春莉 盛辉 孙连坤 康劲松
【摘要】 目的 研究初生大鼠注射雄激素后，在成年期给予林蛙卵油灌胃，对于卵巢凋亡的影响，分析林蛙卵油的卵巢保护作用机制。方法 乙醇萃取法提取林蛙卵精油，初生期给予雄激素制造卵巢凋亡大鼠模型，分为4组：高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型组，同时设正常对照。大鼠成年后给予各剂量组林蛙卵油灌胃后处死，TUNEL检测凋亡比率。结果 TUNEL染色显示模型组的凋亡指数较正常组升高，给予林蛙卵油后，凋亡指数降低(P&<0.05)。正常组与模型组之间有显著性差异(P&<0.05)，中剂量组和大剂量组与模型组比较有显著差异(P&<0.05)，小剂量组与模型组比较无显著差异(P&>0.05)。结论 林蛙卵油可能通过抑制大鼠卵巢细胞的凋亡，发挥保护卵巢的作用。
【关键词】 林蛙卵油;凋亡;卵巢
【Abstract】 Objective To study the ovary apoptosis factors change in androgen injection model of newborn rats and the protective mechanism of ovumoil of Rana temporaria chensinensis David.Methods The ovumoil was abstracted from the ovum of Rana temporaria chensinensis David by ethyl alcohol extraction method.Ovaryinjury model rats were established by androgen injection on newborn rats，when these rats grew up，administrated intragastrically by the ovumoil.Then the rats were killed to test apoptotic index by TUNEL.Results The apoptotic index in model group was higher than that of normal group.The ovum oil administration obviously decreased the apoptotic index(P&<0.05). Conclusions The ovary protection of ovum oil on ovary is due to inhibition on apoptosis of ovary cell.
【Key words】 Ovumoil of Rana temporaria chensinensis David;Apoptosis;Ovum
我国早有药食同源的传统，中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)为两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属动物，俗称哈士蟆，又称哈蚂、田鸡。中国林蛙的干燥输卵管称为林蛙油，其性平、味甘、咸，入肺经、肾经，具有健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津、抗衰老、抗疲劳之功效，是一种名贵食疗性中药。近年研究显示由取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油的保健价值更高〔1，2〕。本研究旨在观察林蛙卵油对于大鼠卵巢凋亡指数的影响，分析其对卵巢细胞的保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物及雄激素处理模型的复制 选择9日龄Wistar清洁雌性大鼠50只，其中模型组40只，丙酸睾酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射，建立丙酸睾酮诱导的大鼠模型;分别为林蛙卵油高、中、低剂量组，模型组各10只;正常组10只，同期生理盐水皮下注射。各组在造模成功后喂养110 d至成年。模型组和正常组用生理盐水3 ml/d灌胃;林蛙卵油各剂量组应用林蛙卵油灌胃，剂量为0.1，0.4，1.0 g/d，用生理盐水稀释至3 ml，灌胃15 d后处死大鼠〔3〕。右侧卵巢放入甲醛固定后进行HE染色和免疫组化实验〔3〕。
1.2 卵油提取与精制 吉林省桦甸产成龄林蛙，当年初冬捕获，在剥取林蛙油的同时取林蛙卵巢。将林蛙卵巢自然晾干，除去杂质，用乙醇冷浸3次，过滤得卵渣，并减压回收乙醇，再过滤除去少量沉淀物，又得浅黄棕色液体粗卵油。将卵渣再反复用乙醇浸泡，直至乙醇液基本无色，倾出乙醇，并干燥、粉碎。所得乙醇液仍在减压下回收，卵油并入粗卵油中。粗卵油中加入2倍量的乙醇稀释后，加入20%的中和剂(兼有脱水作用)，搅拌均匀，放置1 h后过滤，减压回收乙醇，即得黄棕色液体精制卵油〔3〕。
1.3 免疫组织化学实验 部分切片进行常规HE染色。TUNEL和DAB显色试剂盒购自Sigma公司。用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)进行免疫组织化学染色，镜下观察。TUNEL染色阳性为细胞核出现棕黄色颗粒。凋亡指数(AI) 计算方法:随机选择10个凋亡肿瘤细胞数占所有肿瘤细胞数的百分比(细胞凋亡%=凋亡的细胞数/细胞总数×100%)。
1.4 统计学处理 数据用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行t检验。
2 结 果
2.1 常规HE染色卵巢镜下观察 模型组可见大量呈囊性扩张的原始卵泡，颗粒细胞层次减少，排列松散，卵细胞消失，内含大量浆液性物质，生长卵泡数目较少，极少见黄体出现。而正常组可见各期卵泡及黄体组织，未见囊性卵泡。林蛙卵油高、中、低剂量组生长卵泡数目明显增多，可见成熟卵泡及黄体，卵泡未见明显的囊性扩张。见图1。图1 各组大鼠常规HE染色卵巢阳性结果(×400)
2.2 TUNEL免疫组织化学染色结果 模型组的凋亡指数(43±1.97)较正常组(22±0.92)明显升高(P&<0.05)，给予林蛙卵油后，凋亡指数降低，中(30±0.74)和高剂量组(31±0.96)与模型组比较有显著性差异(P&<0.05)，小剂量组(39±1.12)与模型组比较无显著差异(P&>0.05)。
3 讨 论
林蛙卵中含有多种微量元素，其中Zn含量高，Zn/Cu比值高;含有18种氨基酸，其中必需氨基酸的总量高;富含雌二醇、孕酮;林蛙卵油富含不饱和脂肪酸、磷脂成分，含有维生素A、D、E、C等及人体必需的微量元素〔1，2〕。彭飞等的研究证实林蛙卵油具有温和的降低血脂，软化血管，抑制血小板聚集、改善血液流变学特征、抑制血脂沉积作用〔4〕;又有一定的中枢抑制作用〔5，6〕，林蛙卵油具有明显的增强机体抗脂质过氧化损伤，调节免疫的抗衰老的生物作用〔4〕，没有明显毒副反应。
细胞凋亡是细胞的一种具有形态学变化而不同于细胞坏死。细胞凋亡具有其典型的形态特征和生化特征。凋亡发生在卵子形成、卵泡形成、卵子丢失/分泌和卵泡闭锁过程中。凋亡在卵巢退化中发挥作用，一些存活前和凋亡前因子在卵巢凋亡过程中发挥作用，它们之间的精细调节对于卵巢的最终命运发挥了决定性作用：闭锁过程主要有Bcl2家族成员、TNF和caspases参与;排卵有Bcl2，Bax，促卵泡激素(FSH)，抑制素(inhibin)，Fas配体，caspases等参与;黄体形成和变性有Fas/Fas配体，caspases3，Bax，prohibitin等参与〔7，8〕。
我们制作的雄激素模型可以表现出卵巢中卵泡囊状扩张、不排卵进而不孕的生物学行为，所以这种模型被作为不孕症或者多囊卵巢综合征的实验研究模型，在排卵功能上和形态学上代表了两种疾病的最关键的表型，说明给予初生大鼠大剂量雄激素可以使成年大鼠的卵巢损伤，表现在卵巢萎缩，生长卵泡数量减少和排卵功能的缺失。给予林蛙卵油灌胃后对于这种卵巢损伤有纠正作用，卵巢形态学上恢复正常卵巢的状态，黄体的出现说明排卵功能的恢复。
通过TUNEL染色观察大鼠卵巢的凋亡指数发现：模型组的凋亡指数较正常组升高，给予林蛙卵油后，凋亡指数降低。正常组与模型组之间有显著性差异，中剂量组和大剂量组与模型组比较有显著性差异，小剂量组与模型组比较无显著性差异。说明雄激素促进卵巢凋亡，给予林蛙卵油灌胃后降低卵巢细胞的凋亡，这种保护作用有一定的剂量依赖性，需要林蛙卵油浓度达到一定程度才能实现。提示林蛙卵油可能通过抑制卵巢细胞的凋亡，发挥保护卵巢的作用。
参考文献
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