骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血的研究进展

【关键词】 骨髓基质干细胞；移植；脑缺血

　　缺血性脑血管病严重威胁着人类健康，具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点。目前脑缺血的治疗手段主要有溶栓、抗凝及应用神经保护剂等，但不能从根本上切实有效的修复受损脑组织。近年来骨髓基质干细胞被广泛应用于移植研究中，尤其是对于脑缺血等各种中枢神经系统疾病，更是成为研究的热点。作为细胞治疗的细胞来源之一，骨髓基质干细胞分化潜能好、来源丰富、不存在胚胎干细胞移植所带来的伦理学问题，又可用于自体移植，免除了宿主可能的免疫排斥反应，具有良好的应用前景〔1〕。

　　1 骨髓基质干细胞的生物学特性
　　
　　骨髓基质干细胞具有自我更新〔2〕和多向分化能力〔3〕。在生理稳态情况下，体内大多数骨髓基质干细胞增殖不明显，但在体外补充适量血清的培养液中，它们能贴壁生长，表现出旺盛的有丝分裂活动和增殖能力。大量研究证实，在一定诱导条件下骨髓基质干细胞可向成骨细胞〔4，5〕、成软骨细胞〔6〕、成肌细胞〔7〕、肌腱细胞、脂肪细胞及基质细胞等中胚层细胞分化;同时骨髓基质干细胞还可以向外胚层的神经细胞〔8〕和内胚层的肝细胞分化〔9〕。骨髓基质干细胞是细胞移植治疗脑缺血等各种中枢神经系统疾病理想的细胞来源〔10〕。

　　2 骨髓基质干细胞的分离、培养
　　
　　目前常用的分离方法主要有三种：密度梯度离心法、贴壁培养筛选法和流式细胞仪分选法。①密度梯度离心法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，利用细胞分离液通过离心分层，将有核细胞和血细胞分离的方法。具有操作简便，所得骨髓基质干细胞纯度较高，对活性影响小等特点。②贴壁培养筛选法，即根据骨髓基质干细胞的黏附贴壁生长而血细胞在培养液中悬浮生长的特性上的差异，通过定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化骨髓基质干细胞的目的。此法操作简单，但获得的骨髓基质干细胞纯度低，混杂细胞较多。③流式细胞仪法，是利用免疫学方法应用流式细胞仪识别已标记的骨髓基质干细胞表面标志，将所需细胞进行分离的方法。由于此方法试剂、仪器价格昂贵，技术要求较高而且分选过程中可造成细胞损伤和死亡、经过此法分选的细胞出现增殖缓慢等问题，目前尚未广泛应用。骨髓基质干细胞的培养目前多采用贴壁细胞培养法。培养条件为利用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的LDMEM培养基，置于37℃、5% CO2、80%湿度的培养箱内培养。

　　3 骨髓基质干细胞的移植途径、移植数量、移植时机

　　3.1 骨髓基质干细胞的移植途径

　　目前骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血的途径有3种:静脉途径、动脉途径、脑内局部注射。①静脉途径：静脉输入骨髓基质干细胞选择性迁移至脑缺血区的机制可能为血脑屏障的破坏有利于骨髓基质干细胞选择性进入缺血半球，卒中后局部的微脉管系统表达黏附因子吸引炎性细胞及血管中的骨髓基质干细胞向损伤区迁移〔11〕。②动脉途径：可将骨髓基质干细胞直接经缺血侧颈内动脉注入。其较脑内注射侵袭性小，较为安全，移植细胞在损伤区的存活率也较脑内注射高。但动脉途径与静脉途径一样，都属于全身输注，因此不可避免地会播散到身体其他器官。③脑内局部注射：根据缺血损伤的部位采用脑立体定向术，将一定体积、适当数量的骨髓基质干细胞直接注射到缺血损伤部位。此途径具有可以将骨髓基质干细胞直接送达缺血部位，提高移植物抵达靶点的数量的特点。但其对脑组织产生一定的损伤;移植物的数量受一定程度的限制;不便多次多靶点注射〔12〕。

　　3.2 骨髓基质干细胞的移植数量

　　移植骨髓基质干细胞在体外的传代次数多会影响其生物学活性，而移植细胞数量的增多会加大对其安全性的顾虑，移植的细胞数量过少又难以起到治疗的作用。Chen等〔13〕的研究发现静脉移植1×106骨髓基质干细胞对MCAO大鼠的功能恢复无明显作用，而3×106组则显示了明显的功能改善。有体外扩增骨髓基质干细胞自体移植治疗大脑中动脉供血区梗死病人的临床研究报道，Bang OY等〔14〕对病人经静脉途径自体移植了1×106个细胞，移植后症状明显改善，而且观察一年未发现与移植相关的不良反应。目前多移植1×106～1×107个骨髓基质干细胞用于恢复神经功能。

　　3.3 骨髓基质干细胞的移植时机

　　骨髓基质干细胞移植时间点的选择要综合考虑，必须考虑到脑损伤的自然恢复过程，延迟到缺血后恢复的自然稳定期，但过分延长移植的等待时间，会导致瘢痕组织形成，不利于移植。目前在骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血的动物研究中，骨髓基质干细胞移植时间为缺血模型建立后1～28 d不等。

　　4 骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血的机制
　　
　　可能机制有以下几个方面：①细胞替代作用〔15〕：移植入脑组织的骨髓基质干细胞通过分化为神经细胞，重建了局部神经环路，代偿了损伤细胞的功能，即认为是干细胞发挥了“替代”作用。Englund等〔16〕发现骨髓基质干细胞移植入大鼠脑内后分化的细胞具有神经元形态和表面标志，与邻近神经元形成广泛连接，并观察到了新生神经元产生的动作电位。Wang等〔17〕研究显示单核细胞趋化蛋白1能促进骨髓基质干细胞迁入缺血的脑组织。骨髓基质干细胞通过血脑屏障向病变部位迁移，对周围环境、细胞因子和一些信号作为反应，与周围组织发生联系，表达神经元特有的标志蛋白，如微管联合蛋白2、神经元特性烯醇化酶、神经丝和胶质纤维酸性蛋白等。与病变周围组织渗透融合、替代损伤细胞、重建神经环路，从而达到恢复神经功能的目的。②分泌各种营养因子:研究表明，缺血性大脑组织的提取物能促进体外培养的人的骨髓基质干细胞分泌脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子(HGF)，而且这些营养因子的增加与脑缺血时间呈依赖关系〔18〕。NGF能够促进中枢神经系统中特定神经元的存活和分化，并在脑损伤后的神经可塑性、再生潜能及神经凋亡的抑制中扮演重要角色〔19〕;BDNF促进轴突生长〔20〕、提高神经存活及抗损伤能力。通过拮抗兴奋性氨基酸毒性、稳定细胞内钙离子浓度、减少自由基损伤、抑制细胞凋亡等对神经细胞具有重要的保护作用和促进神经细胞功能恢复作用〔21〕。③促进缺血区新血管再生：血管新生与功能恢复有关，因为血管形成是正常组织修复中不可缺少的过程〔22〕。Chen等〔23〕通过静脉给大脑中动脉栓塞24 h的大鼠注射人骨髓基质干细胞，用激光扫描共聚焦显微镜、免疫组织化学及ELISA方法分析缺血边缘带的血管发生和宿主脑内的VEGF及其受体水平，发现骨髓基质干细胞能促进大鼠脑内血管发生，可能与骨髓基质干细胞增加了内源性VEGF及其受体水平有关。Chen等〔24〕将骨髓基质干细胞移植入永久性局灶性脑缺血模型大鼠，14 d后发现移植大鼠的神经功能显著改善，凋亡细胞明显减少及微血管密度的显著增加。④促进内源性神经干细胞增殖：在成年哺乳动物室管膜下区、海马齿状回的颗粒下区，甚至在其他部位，比如纹状体、脊髓、大脑皮质都存在着具有神经再生能力的内源性神经干细胞。Chen等〔25〕给短暂性大脑中动脉闭塞的雌性大鼠静脉注射雄性大鼠骨髓基质干细胞，通过Y染色体标记的方法发现，移植细胞能在宿主脑内存活并向同侧缺血半球集中，与对照组相比，移植组侧脑室下区的溴脱氧尿苷（BrdU）阳性细胞数明显增多，说明骨髓基质干细胞能促进大鼠内源性神经干细胞的增殖。

　　5 骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血存在的问题和展望

　　骨髓基质干细胞移植治疗脑缺血的研究已经取得很大进步，但仍然存在一些问题和争论有待我们研究探讨:①骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞后，是否具有神经细胞的一系列功能，尽管有些实验做出了分化后的神经元样细胞的电生理的功能指标，但是各个实验室的实验条件不同，缺乏统一的标准，故这些结果还有待进一步验证。②骨髓基质干细胞在宿主体内分化为神经细胞的数量有多少，存活时间有多长，如何提高骨髓基质干细胞在体内的成活率和向神经细胞定向分化的能力。③细胞移植后能否整合入宿主的神经环路，能否与其他神经元产生突触联系进而分泌神经递质，能否与其他神经细胞之间建立精确的联系。④目前的骨髓基质干细胞的移植实验为先在体外诱导分化为相应组织细胞后再植入人体内，倘若对其进行诱导分化操作会改变细胞特性，是否有发展为肿瘤可能。
　　
　　骨髓基质干细胞具有取材方便，扩增迅速，多向分化潜能等特点〔26〕，尤其在自体骨髓基质干细胞移植中克服了诸如伦理、免疫排斥等问题。因此，骨髓基质干细胞在治疗缺血性脑损伤中具有广阔的应用前景。

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