注射链脲佐菌素对小鼠血液、胰腺ROS及生长抑素的影响

　　　　　　作者：沈丽珍 施用晖 李 武 代国杰 郑舟怡 乐国伟

【摘要】 目的 观察注射链脲佐菌素 (STZ)小鼠血糖、活性氧族 (ROS)、抗氧化酶、胰岛素 (INS) 和生长抑素 (SS) 的变化，探讨ROS和SS在糖尿病(DM)发生过程中的作用。方法 昆明种小鼠腹腔注射STZ枸橼酸缓冲液，分别在注射后0、1、3、6、12和24 h测定血糖、INS及SS水平、ROS、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶 (GSHPx) 活力及丙二醛 (MDA)。结果 全血、胰腺、肝脏ROS在注射后即开始升高，分别在6 h、3 h和6 h到达峰值。血清、胰腺SS分别在6 h和3 h降至最低值。血清INS水平在6 h时显著高于各时间点。3 h血糖水平显著高于其他各时间点，6 h明显降低。血液、胰腺和肝脏GSHPx和SOD活力在注射后均显著降低，同时MDA含量则显著升高。相关性分析显示，全血、胰腺ROS和SS呈显著负相关，而全血ROS和血清INS则为显著正相关。结论 STZ产生大量ROS损伤SS表达分泌，使SS对胰腺B细胞保护作用减弱，进一步损害B细胞，INS分泌异常，血糖随之改变，ROS损伤SS分泌是STZ诱导产生DM的重要原因。

【关键词】 活性氧族;糖尿病;生长抑素;链脲佐菌素

　链脲佐菌素(STZ)是从链霉素中分离出来的抗生素，由葡萄糖和甲基化氮源部分组成，结构与葡萄糖相似，能够通过葡萄糖转运载体2(GLUT2)转运进入细胞，因而对含有高水平GLUT2的胰腺B细胞更易产生毒性〔1〕。胰腺内抗氧化酶活性低，更容易受到自由基的攻击〔2〕，STZ诱发的活性氧族(ROS)在胰腺损伤中发挥着重要作用。生长抑素(SS)是一种调节性抑制肽，有广泛生物学活性，现在认为SS对许多疾病如糖尿病(DM)、肿瘤、帕金森病等的发生、发展及防治具有重要意义〔3，4〕。胰岛D细胞能够分泌具有抗氧化功能的SS，能抑胰岛素(INS)分泌，进一步减少糖代谢产生的自由基。认识SS在控制自由基的水平，防止胰岛氧化损伤中的作用，将有助于认识DM发生机制，为防治DM提出新的控制与治疗手段。本研究通过腹腔注射STZ后小鼠血液、胰腺SS、ROS以及血糖水平变化，研究SS在控制ROS水平、INS、血糖以及体内抗氧化活性中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 清洁级昆明种小鼠，雄性，4～6周龄，体重14～19 g，同室分笼正常日粮饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境温度控制在(23±2)℃，湿度60%。

　　1.1.2 试剂 STZ(Bio Basic Inc公司);辣根过氧化物酶(HRP)(北京拜尔迪生物公司);鲁米诺(苏州亚科化学有限公司);邻苯三酚(AR级)(中国医药集团上海化学试剂公司);INS、SS放射免疫试剂盒(北京华英生物技术公司);MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.1.3 主要仪器 血糖仪(美国琼森life scan);MPIB型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器公司);低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂);超低温冷冻冰箱(美国INVETRO公司);Multiskan Mk3酶标仪(美国Thermo公司);UV1100型紫外分光光度计(北京瑞利科学仪器有限公司)。

　　1.2 分组与模型制备 昆明小鼠随机分成6组，每组10只，适应喂养1 w，禁食12 h后称重，每只小鼠以150 mg/kg体重单次腹腔注射0.1 ml新鲜配制的STZ枸橼酸缓冲液，分别在注射后0、1、3、6、12和24 h摘眼球取血，置肝素抗凝管中，立即加入抑肽酶混匀，离心取上清低温保存待测。迅速取出胰腺和肝脏，制备组织匀浆液，离心取上清-20℃保存待测。

　　1.3 观察指标和测定方法 琼森Life Scan血糖仪快速测定血糖;血、胰腺INS和SS用放射免疫法由北京华英生物技术公司测定;血、胰腺和肝脏ROS采用Luminol化学发光法测定;血和组织匀浆中SOD采用邻苯三酚自氧化法测定;GSHPx采用DTNB直接法测定;MDA含量按南京建成生物工程研究所测定试剂盒说明书进行。

　　1.4 统计学方法 采用Origin 7.0软件对ROS进行积分统计，Excel对实验资料进行统计和整理，结果以x±s表示，采用SPSS17.0 统计软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠血液、胰腺和肝脏ROS水平 注射STZ后全血ROS开始升高，于6 h处达到最高点，显著高于0 h水平(P&<0.01)，随后降低，24 h内小鼠全血ROS水平呈现升高降低升高趋势。胰腺、肝脏ROS在注射后也逐渐上升，胰腺ROS水平在3 h后达到最高点，显著高于0 h水平(P&<0.01)，之后出现降低，注射STZ 24 h后，ROS保持在注射前的150%。肝脏ROS水平在3 h时是0 h的142%(P&<0.01)，并于6 h达最高值，注射24 h后ROS仍是注射前的158%。见表1。表1 注射STZ后小鼠血液、胰腺和肝脏ROS水平

　　2.2 小鼠SS水平 注射STZ后1 h时血清SS水平升高10%，但在3 h则降低12.6%(P&<0.05)，6 h时显著降低到(12.94±1.79)pg/ml(P&<0.01)，此后处于低水平状态。胰腺SS水平在1 h处显著高于0 h 17%(P&<0.01)，而3 h后出现降低23.5%，6 h处有短暂的升高，12 h后处于低水平，见表2。表2 注射STZ后小鼠血液和胰腺SS水平

　　2.3 小鼠INS和血糖水平 在注射STZ短时间内小鼠血清INS有轻微降低，但差异不显著。6 h时血清INS显著升高(P&<0.01)，随后逐渐下降。注射STZ 3 h后血糖，显著高于其他时间点水平(P&<0.01)，但在6 h降到最低点，显著低于各时间点水平(P&<0.01)，之后逐渐上升。血糖呈现升高降低升高的趋势，见表3。

　　2.4 小鼠血液、胰腺抗氧化指标变化 0 h血液GSHPx活力最高，注射STZ后其活性降低，6 h处降到最低值，显著低于其他时间点水平(P&<0.01)。0 h血清MDA含量最低，随STZ注射时间延长其含量渐渐升高，在6 h时达最高，与0 h比较，差异有统计学意义(P&<0.01)。胰腺GSHPx和SOD活力在注射STZ后均逐渐降低，于3 h处活力降至最低，与0 h比较差异有显著性(P&<0.01)。胰腺MDA含量在注射1 h后有所升高，3 h时达到显著水平(P&<0.01)。见表4。表3 注射STZ后小鼠INS和血糖变化表4 注射STZ后小鼠血液与胰腺抗氧化指标变化

　　2.5 小鼠肝脏抗氧化指标变化 肝脏GSHPx和SOD活力在0 h时均为最高，注射STZ后其活力逐渐降低，在6 h时降到活力最低点，与0 h相比差异显著(P&<0.01)。注射后MDA含量开始升高，3 h时达到显著水平(P&<0.01)，并于6 h处达到最高值。见表5。

　　2.6 ROS、SS和INS的相关性分析 相关性分析结果显示，胰腺ROS与SS之间呈显著负相关(r=-0.544，P&<0.01)。全血ROS与血清SS之间呈显著负相关(r=-0.477，P&<0.01)。而全血ROS和血清INS之间则呈显著正相关(r=0.485，P&<0.01)。表5 注射STZ后不同时间点小鼠肝脏抗氧化指标变化

　　3 讨 论

　　氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时，自由基产生和抗氧化防御之间的动态平衡被破坏，导致细胞损伤的过程。与氧化应激密切相关的主要为ROS。早期DM患者全膜抗氧化状态(TAS)明显降低，提示DM早期患者抗氧化防御系统功能即全面下降。Wilmm等〔5〕使用一种新型抗氧化剂Lazaroid，减少ROS的产生，在很大程度上缓解了胰岛B细胞的损伤。说明氧化应激与DM有关，ROS在DM发病机制中起作用。

　　STZ致DM的机制目前尚未完全清楚。一些研究表明，STZ能在B细胞内产生自由基，使用抗氧化剂可减轻由STZ引起的氧化应激〔2，6，7〕。Takasu等〔8〕提出过氧化物和羟自由基导致的DNA断裂在DM发展中有重要作用。大鼠胰腺体外实验证明STZ和四氧嘧啶 (ALX) 能刺激产生h3O2，进而使胰腺细胞DNA断裂，并且其产生自由基的量随药物浓度升高而升高。本研究证明，注射STZ后，首先在胰腺产生大量ROS，这与STZ选择性作用于胰腺的报道是一致的。同时，小鼠血液、胰腺和肝脏ROS水平都升高。INS提高肌肉和脂肪组织细胞膜葡萄糖载体表达与分泌，促进将葡萄糖转运入细胞，降低外周血糖，但促进葡萄糖进入肝脏与肌肉代谢过程中同时产生大量ROS。

　　ROS的增加改变了小鼠体内氧化还原状态的平衡，本研究小鼠血液GSHPx活力在注射STZ后逐渐降低，而MDA含量则开始升高，在血液ROS最高点时，GSHPx活力最低，而MDA含量最高。胰腺及肝脏GSHPx和SOD活力均有下降，分别在各自ROS水平达到最高时，其活力降到最低值，MDA含量则出现升高。结合ROS水平，说明STZ产生的大量ROS使小鼠抗氧化防御系统功能减弱，出现氧化应激，脂质过氧化产物增加。因此，STZ诱导DM的首先途径是产生大量ROS，氧化还原状态失衡，进而破坏胰岛细胞导致DM。

　　SS是一自身具有抗氧化活性，调节机体氧化还原状态的环状多肽类激素。SS及其类似物可影响体内许多激素的分泌。善宁可通过与SS受体结合，抑制INS分泌，对B细胞起到保护和修复的作用〔9〕。屠亚红等〔10〕用外源性注射SS和用半胱胺特异性耗竭内源性SS的方法，观察SS对STZ糖尿病小鼠血清INS的影响，结果表明外源性SS有预防STZ诱发小鼠低血清INS发生的作用，而胰腺组织中内源性SS也可能是对胰岛B细胞起保护作用的因素之一。整体动物试验及细胞水平研究均证明SS可通过增强细胞对ROS的清除能力而对胃黏膜细胞起保护作用。八肽生长抑素可减轻OH对孵育状态下人胃黏膜细胞的损伤，减轻细胞脂质过氧化程度〔11〕。结合ROS和SS的变化，可看出全血及胰腺ROS在注射后短时间内出现轻微上升时血清SS亦有所上升，随时间ROS继续升高，SS则开始出现下降，当ROS达到最高点时，其含量降到最低点。胰腺ROS和SS相关性分析显示，两者呈显著负相关，全血ROS和SS的相关性分析同样为显著负相关。实验室前期研究结果表明，一定范围内ROS可能是刺激SS分泌的信号。随高脂饲料喂养小鼠时间延长，ROS水平剧增，高水平ROS损害SS表达分泌系统，添加抗氧化剂显著降低ROS水平，提高SS表达。最初ROS的升高可作为一种刺激，引起SS分泌和释放，内源性SS在一定范围内能清除STZ诱导产生的ROS。但当ROS浓度过高时，对胰腺D细胞有损伤作用，导致SS分泌、释放减少，减弱清除胰腺内ROS能力和对B细胞保护作用，进而胰腺B细胞受到大量ROS攻击、破坏，最终导致DM的出现。另外，胰腺6 h处SS有短暂升高现象，和B细胞的破坏导致INS大量释放一样，可能为ROS破坏了部分D细胞，释放细胞内SS所致。

　　观察注射STZ后6个时间点的血糖和INS，可看出有三个明显变化的时相。注射后1 h，血糖略有升高，而血清INS略有降低，此时相可能为药物抑制INS释放所致，3 h血糖出现显著升高。血清INS在6 h的时候明显上升，血糖相应显著下降，呈低血糖相，可能为胰岛B细胞破坏释放大量INS所致。随后INS开始下降，血糖继而上升，B细胞破坏导致INS产生不足，此后血糖升高并维持在高水平即高血糖相。

　　综上所述，STZ诱导产生ROS，ROS损伤SS表达分泌系统，使SS分泌减少，氧化还原状态失衡，减弱SS对胰腺B细胞保护作用，进一步损害B细胞，INS异常分泌，加快血糖进入细胞，加强代谢而ROS增加，从而产生DM。

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