代谢型谷氨酸受体在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的作用

　　　　 作者：柯昌斌 黄晓霞1 罗向红 李清 刘菊英

【摘要】 目的 评价代谢型谷氨酸受体(mGluR5)在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的作用。方法 3月龄Wistar大鼠，雌雄不限，体重180～220 g，单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg制备糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型。模型制备成功大鼠64只，随机分为2组(n=32)，糖尿病神经病理性疼痛组(D组)和mGluR5拮抗剂组 (M组)，另取32只正常大鼠作为对照组(C组，n=32)。M组腹腔注射mGluR5拮抗剂20 mg/kg，1次/d，C、D组注射等体积生理盐水。各组分别于第2、4、6、8 周(T1～4)末随机取8只大鼠，采用von Frey纤维丝测定双后足机械缩足反应阈值(MWT)，取L3～6脊髓，采用免疫组化法和RTPCR法检测mGluR5的mRNA水平。结果 与C组比较，D组T1～4时MWT降低，mGluR5 mRNA水平升高(P&<0.05);与D组比较， M组T1～4时MWT升高mGluR5 mRNA水平下降(P&<0.05)。结论 mGluR5激活参与大鼠糖尿病神经病理性疼痛的形成。

【关键词】 受体;代谢型谷氨酸;糖尿病神经病变;神经痛

　　【Abstract】 Objective To evaluate the role played by mGluR5 in diabetic neuropathic pain (DNP) in rats. Methods 96 Wistar rats 3 months old weighing 180～220 g were randomly pided into 3 groups: groupⅠcontrol (C); groupⅡ DNP; group Ⅲ MPEP (selective mGluR5 inhibitor) + DNP. Diabetes mellitus (DM) was induced by intraperitoneal streptozocin 65 mg/kg. Blood glucose level was measured every week for 4 weeks. DM was confirmed by blood glucose level ≥16.0 mmol/L in the 4th week. Mechanical paw withdrawal threshold to von Frey filament stimulation (MWT) was measured at the end of the 4th week. Diabetic rats with significant decrease in MWT were used in groupⅡand Ⅲ. Starting from the 5th week after DNP had been induced， MPEP 20 mg/kg were given by intraperitoneal injection once a day in group Ⅲ. Eight animals were taken from each group for MWT measurement at the end of the 2nd， 4th， 6th and 8th week after the model was successfully made respectively. The rats were then killed and the lumbar segment of the spinal cord were removed for microscopic examination and determination of the level of mGluR5 mRNA. Results The MWT were significantly lower and the mGluR5 mRNA level were significantly higher in groupⅡ，MPEP significantly attenuated the diabetesinduced changes in group Ⅲ. Conclusions mGluR5 is involved in the DNP.

　　【Key words】 Receptors; Metabotropic glutamate;Diabetic neuropathies;Neuralgia

　　糖尿病神经病理性疼痛严重影响患者生活质量〔1〕，其发病机制尚不清楚。明确其发病机制，对制定预防和治疗措施有重要意义。研究表明，mGluR5在神经系统的应激性损伤，参与伤害性信息在脊髓水平的传递及中枢调制的过程以及多种神经病理性疼痛的发生〔2～11〕，但在糖尿病神经病理性疼痛中的作用并不清楚。本研究拟评价mGluR5在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及模型复制 Wistar大鼠，雌雄不限，3月龄，体重180～220 g。采用标准化von Frey纤维丝测定机械缩足反应阈值(MWT)的基础值，然后参照文献〔12〕，单次腹腔注射链脲菌素65 mg/kg制备糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型。腹腔注射链脲佐菌素(STZ)后第4周末，再次测定MWT，血糖≥16.0 mmol/L，且与基础值相比MWT下降50%为模型制备成功。

　　1.2 实验分组 模型制备成功大鼠64只，随机分为2组(n=32)，糖尿病神经病理性痛组(D组)、mGluR5拮抗剂组 (M组)，另取32只正常大鼠作为对照组(C组，n=32)。模型制备成功后每周一上午M组腹腔注射mGluR5拮抗剂2甲基6苯基乙炔嘧啶(MPEP) 20 mg/kg，1次/d，C、D组注射等体积生理盐水，直至处死大鼠。

　　1.3 MWT测定 各组分别于模型制备成功后第2、4、6、8 周(T1～4)末随机取8只大鼠，采用von Frey纤维丝测定双后足MWT。使用Von Frey纤维刺激大鼠足底中部，至出现快速缩脚或甩脚反应，从轻至重，每种型号刺激针刺激10次，以出现5次以上缩脚反应为阳性，记录能够引发迅速缩脚反应的最小力度为机械性痛阈阈值。所有大鼠在测完痛阈后均在乙醚麻醉下断头处死，在冰上迅速分离L3～6脊髓，一半于4%多聚甲醛迅速固定，常规石蜡包埋，切片厚3 μm。另一半于液氮中备用。

　　1.4 免疫组化 采用免疫组织化学法检测脊髓mGluR5表达 切片常规脱蜡，加3% h3O2孵育10 min，枸橼酸缓冲液(pH值7.2)中煮沸10 min，血清封闭10 min，移去多余血清，加入mGluR5一抗，4℃孵育12 h。依次加入二抗和辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片。采用LSM510型激光共聚焦显微镜进行观察阳性反应。

　　1.5 mGluR5 mRNA检测RTPCR检测mGluR5 mRNA水平 每100 mg组织加入Trizol 1 ml用玻璃匀浆器匀浆，室温放置10 min，加入200 μl氯仿，12 000 r/min离心10 min;取上清加入500 μl异丙醇，12 000 r/min离心10 min后弃上清;加入75%乙醇1 ml洗涤沉淀，5 000 r/min离心5 min后弃上清;冰上干燥RNA沉淀8 min后用DEPC水溶解。用紫外分光光度仪测定RNA的浓度;用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，通过成像系统检测提取RNA的完整性。用Primer premier 5.0软件设计引物，mGluR5上游引物:5′GTCAGTCTCCTGATGTCAAGTGG3′，下游引物：5′TTTTCACAGAGGCCTGCATAGCCTG3′;βactin上游引物：5′GTCACCAACTGGGACGATATG3′，下游引物：5′GCCTGGATGGCTACGTACATG3′。PCR反应条件：94℃ 10 min预变性，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，循环35次，72℃延伸7 min。mGluR5和βactin同时扩增，条件相同。取上述mGluR5和βActin PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统和凝胶分析系统进行PCR产物扫描和半定量分析，采用目标条带积分光密度值与内参βactin条带积分光密度值的比值表示mGluR5 mRNA的表达相对水平。

　　1.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间及组内比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 MWT检测结果 见表1。D组、M组T1～4的MWT均较C组明显减低(均P&<0.05)，M组较D组水平略高(P&<0.05)。

　　2.2 免疫组化结果 mGluR5主要分布在脊髓背角，C组各时间点的阳性表达很弱，T1到T4，D组mGluR5各时点均有强阳性表达，且逐渐增强。 从T1到T4，M组阳性表达逐渐减弱。

　　2.3 RTPCR结果 与C组比较，D组T1～4时MWT进行性降低，mGluR5 mRNA水平逐渐升高(P&<0.05);与D组比较， M组T1～4时MWT逐渐升高，mGluR5 mRNA的水平逐渐下降(P&<0.05)，见表2。表1 各组MWT的比较表2 各组脊髓mGluR5 mRNA水平比较

　　3 讨 论

　　糖尿病神经病理性疼痛是因糖尿病导致周围神经结构和功能改变而诱发的慢性疼痛，其诊断是依据糖尿病病史结合典型的疼痛症状。本实验结果表明，腹腔注射STZ后第4周大鼠血糖≥16.0 mmol/L，MWT明显下降，提示糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型制备成功。

　　mGluR5属G蛋白偶联受体超家族成员，是神经系统内谷氨酸受体，与谷氨酸结合后发挥生物学效应，参与兴奋性突触的传递、突触发育的可塑性以及对调节神经元的奋性和维持神经细胞的正常功能具有重要作用。在炎性疼痛、神经损伤导致的神经病理性疼痛模型以及神经电生理研究中发现，在脊髓中mGluR5主要分布在脊髓后角Ⅰ～Ⅱ层的突触后膜，脊髓后角是接受躯体痛觉等伤害性刺激信息经C纤维传入的初级门户。C纤维内富含谷氨酸，谷氨酸是外周伤害性信息传递的主要兴奋神经递质之一，当伤害性信息经C纤维传入到脊髓后角，C纤维释放大量的谷氨酸，谷氨酸作用于突触后膜的mGluR5后，引起其激活，通过G蛋白偶联生成第二信使甚至是第三信使，作用于特定的靶位，参与痛觉过敏和触诱发痛等病理性疼痛的形成和维持。可见mGluR5作为痛觉信息传入的初级门户，在痛觉信息神产生及调控有重要作用。在本实验中观察到，糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓后角mGluR5表达明显增强，并且随病程的延长，表达量也逐渐递增。而MWT则进行性降低。因此推测，糖尿病时各种伤害性刺激作用于神经末梢，导致C类纤维过度激活，谷氨酸释放增加，同时引起着脊髓后角mGluR5表达显著上调，共同作用的结果是痛觉信号向初级中枢的传入易化和放大，这可能是诱发糖尿病神经病理性疼痛的一个因素，而过度的兴奋性谷氨酸的释放和mGluR5的激活，导致神经系统的毒性损伤和病理改变也可能参与糖尿病神经病理性疼痛的发生。

　　MPEP是mGluR5的特异性拮抗剂，可以竟争性结合阻断了兴奋性氨基酸与mGluR5的结合，受体激活减少而发挥生物学效应。在神经系统的物理损伤、缺血再灌注损伤以及应激损伤中表现出明显的神经保护作用;在甲醛试验、角叉菜胶疼痛模型和脊神经结扎和脊髓损伤以及炎性疼痛等模型中有治疗慢性伤害性疼痛的作用。在实验中观察到， MPEP 处理明显缓解了疼痛的症状，且随着时间的延长，大鼠MWT进行性升高，说明MPEP对糖尿病神经病理性疼痛有明显的治疗作用。由于MPEP是通过的特异性拮抗mGluR5而发挥生物学效应，MPEP的应用可明显抑制糖尿病神经病理性疼痛，因此，糖尿病引起脊髓后角mGluR5的高表达及高度的激活在糖尿病神经病理性疼痛的产生和维持中有重要作用。这为糖尿病神经病理性疼痛的治疗提供了新思路，可以从mGluR5的转录水平到受体的活化过程对糖尿病时各种伤害性信息向初级中枢的传递过程进行调控，以寻找最佳的治疗方法。

　　综上所述，糖尿病引起大鼠脊髓后角mGluR5的高表达和过度活化，导致各种伤害性信息向初级中枢的传递过程的易化和放大，同时兴奋性谷氨酸释放增加导致神经系统的毒性损伤共同作用的是糖尿病神经病理性疼痛发生和发展的重要环节。

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