人αsynuclein突变体的克隆及细菌表面展示

　　　　 作者：熊莉丽 赵鹏 郭志云 张建华 茆灿泉

【摘要】 目的 在细菌表面构建及展示人αsynuclein突变体A30P、E46K和A53T。方法 采用叠套PCR介导的点突变方法，以野生型αsynuclein为模板。结果 成功克隆了αsynuclein A30P、E46K和A53T 3个突变型基因，并利用细菌亲密素展示系统将野生型αsynuclein及突变体A30P、E46K和A53T成功展示在大肠杆菌表面。结论 αsynuclein及其突变体的细菌表面展示对于αsynuclein空间结构的良好保持和基于αsynuclein神经退行性疾病靶分子药物、分子诊断试剂的研发和αsynuclein蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。

【关键词】 αsynuclein;突变体;生物信息;叠套PCR

　　【Abstract】 Objective To analyze bioinformatics and display of human αsynuclein mutants of A30P， E46K and A53T proteins on the cell surface of Escherichia coli. Methods Overlap extension PCR， a rapid and efficient method by sitedirected mutagenesis was introduced to clone the mutants A30P， E46K， A53T of αsynuclein. Results All the three cloned mutants， including the wild type of αsynuclein， were successfully displayed on the surface of E. coli strains based on the Enterohemorrhagic E. coli Intimin EaeA. Conclusions The work would be of great consequence and values for the better maintaining of the spatial structure of αsynuclein and further targeted drug discovery， molecular diagnostic reagents development for neurodegeneration diseases as well for the study of its protein structure and functions.

　　【Key words】 αsynuclein; Mutant; Display; Bioinformatics; Overlap extension PCR

　　Synuclein基因是1988年由Maroteaux教授在电鳗鱼中发现的〔1〕，到目前为止已在人、鼠、兔等多种脊椎动物中发现存在，主要分为αsynuclein、βsynuclein和γsynuclein 3大类。其中αsynuclein是一类广泛分布于神经中枢系统中的可溶性小蛋白，与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关〔2〕。αsynuclein蛋白主要在神经组织中大量表达，是帕金森病中出现的路易小体的主要组成部分，主要通过蛋白的聚集状态〔3〕、泛素化〔4〕和磷酸化〔5〕等途径来调节其生物活性和生理功能。研究表明αsynuclein蛋白有分子伴侣的活性〔6〕，在神经递质和多巴胺递质的释放、囊泡运输及调节蛋白酶体活性等方面起着重要的作用〔7〕。Polymeropolos等〔8〕、Kruger等〔9〕和Zarranz等〔10〕分别于1997、1998和2004年在家族性帕金森病遗传家族中发现了A53T、A30P和E46K 3个错义突变蛋白，突变蛋白的表达会导致αsynuclein蛋白的异常聚集，形成具有疏水性的寡聚体，表现出较强的细胞毒性，这与帕金森病的发病有着密切的关系〔11〕，但这3个突变基因分布在不同帕金森遗传病家族中，较难直接克隆得到。本文在生物信息分析的基础上，首先利用PCR介导的点突变技术，以αsynuclein野生型基因为模板，克隆了A30P、E46K和A53T 3个突变基因，然后结合细菌展示技术，将野生型αsynuclein与突变体A30P、E46K和A53T展示于大肠杆菌表面。αsynuclein在细菌表面的成功展示对于αsynuclein空间结构的良好保持和基于αsynuclein的神经退行性疾病靶向药物、分子诊断试剂的研发和蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒与菌株 野生型αsynuclein基因由美国哈佛医学院的Yankner教授馈赠;细菌亲密素展示载体paskint100由德国Christmann教授馈赠;pMD18T载体购于大连宝生物工程有限公司;大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

　　1.2 试剂 DNA聚合酶KOD Plus购于日本Toyobo公司;DNA聚合酶rTaq、限制性内切酶BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Bgl Ⅱ、T4连接酶购于大连宝生物工程有限公司;αsynuclein抗体购自美国Santa Cruz biotechnology公司;辣根过氧化物酶体标记的二抗、辣根过氧化物酶DAB显色底物、DNA琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于北京天跟生物有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

　　1.3 生物信息分析 在GenBank数据库中收集αsynuclein相关序列，序列比对及蛋白理化小生质分析采用Bioedit软件。在http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl网站进行蛋白质二级结构分析;采用SWISSMODE分析蛋白三级结构。

　　1.4 αsynuclein突变型基因A30P、E46K和A53T的克隆 采用叠套PCR介导的点突变法克隆各突变基因，根据Gen Bank提供的野生型αsynuclein核酸序列，使用软件Primer Premier 5.0分别设计A30P和A53T和E46K点突变引物 (Primer A、B、Ⅰ、Ⅱ)。为了便于PCR扩增，引物A和B都设计在载体上;扩增αsynuclein全长的正向引物5′端引入Sma I，反向引物5′端引入Bgl Ⅱ(BamH Ⅰ的同尾酶)，各引物序列如表1所示。以野生型αsynuclein为模板，进行两轮PCR反应，突变后的PCR产物回收加A后连接至pMD18T载体并送样测序。表1 用于突变体构建及展示的引物

　　1.5 αsynuclein展示载体的构建 用正义和反义链引物分别以野生型αsynuclein及突变成功的A30P和A53T、E46K为模板进行PCR扩增，回收的PCR产物连接至pMD18T载体，测序成功后经Sma Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切，再连接到经BamH Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切的paskint100上，转化DH5α，挑取单克隆摇菌提取质粒，酶切鉴定阳性克隆。

　　1.6 αsynuclein细菌表面展示 测序正确的质粒 (paskintWT、A30P、E46K和A53T) 转化至大肠杆菌DH5α，挑取单克隆于LB中37℃摇菌3～4 h后，按1∶100转接至50 ml 锥瓶中37℃振荡培养至OD600 为0.6～0.8时，加入诱导物四环素至终浓度12.5 μg/L，37℃振荡培养诱导8 h后，离心收集菌体，提取蛋白后经12%的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDSPAGE) 检测蛋白展示。

　　1.7 Western印迹分析 诱导表达后的菌体蛋白经12%的SDSPAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上，依次经兔源αsynuclein抗体、辣根过氧化物酶体标记的羊抗兔结合;最后经辣根过氧化物酶二氨基联苯氨(HRPDAB)底物显色检测αsynuclein蛋白的展示。

　　2 结 果

　　2.1 突变体A30P、E46K和A53T的克隆 用引物A、B以及含A30P、E46K和A53T突变位点的引物Ⅰ、Ⅱ 分别进行PCR扩增，PCR电泳结果如图1所示。A30P、E46K和A53T突变位点上游引物 (A和Ⅱ) 都扩增出一条约为500 bp的条带;A30P、E46K和A53T突变位点下游引物 (Ⅰ和B) 都扩增出一条约为400 bp的条带;采用PCR连接的方法将A30P、E46K和A53T突变位点上、下游扩增片段连接起来，电泳结果如图1所示。A30P、E46K和A53T经PCR连接后都扩增出一条约1 kb的条带。突变后的αsynuclein测序结果如图2所示，突变体A30P的88位碱基突变成功，由G突变为C，翻译的氨基酸则由丙氨酸突变为脯氨酸;突变体E46K的136位碱基突变成功，由G突变为A，翻译的氨基酸则由谷氨酸突变为赖氨酸;突变体A53T的157位碱基突变成功，由G突变为A，翻译的氨基酸则由丙氨酸突变为苏氨酸。

　　2.2 αsynuclein WT、A30P、E46K和A53T展示载体的构建 以野生型αsynuclein及突变成功的A30P、E46K和A53T的质粒为模板，用正、反义引物均扩增出一条略小于500 bp的条带，

　　(A)含突变位点A30P的αsynuclein PCR扩增;(B)含突变位点E46K的αsynuclein的PCR扩增;(C)含突变位点A53T的αsynuclein PCR扩增。1U是引物A和Ⅱ的PCR扩增结果，1D是引物I和B的PCR扩增结果，2F是1D和1U产物通过PCR连接的扩增结果，M：Marker图1 αsynuclein突变型基因A30P、E46K和A53T的克隆

　　(a)88位碱基突变的αsynuclein A30P测序结果;(b)野生型αsynuclein 88位碱基测序结果;(c)157位碱基突变的αsynuclein A53T测序结果;(d)野生型αsynuclein 157位碱基测序结果;(e)136位碱基突变的αsynuclein E46K测序结果;(f)野生型αsynuclein 136位碱基测序结果图2 野生型人αsynuclein及突变体A30P、

　　E46K和A53T的测序结果与预期大小相一致。分别将其亚克隆至细菌展示载体paskint100，命名为paskintWT、A30P、E46K和A53T。经酶切鉴定及测序结果分析，paskintWT、A30P、E46K和A53T展示载体构建成功。

　　2.3 αsynuclein WT、A30P、E46K和A53T的展示 将构建成功的paskintWT、A30P、E46K和A53T质粒转化至大肠杆菌DH5α，挑取单克隆摇菌诱导蛋白的表达。SDSPAGE凝胶电泳检测目标蛋白表达情况。paskintWT、A30P、E46K和A53T与未经四环素诱导的对照相比，在85 kD附近有一条明显的蛋白条带(其中包括660个氨基酸的膜蛋白亲密素和140个氨基酸的αsynuclein)，这与预期的蛋白条带大小相一致;进一步以αsynuclein特异性结合抗体来检测细菌表面αsynuclein展示情况，由图3可以看出诱导后paskintWT、A30P、E46K和A53T都可以与αsynuclein抗体反应，出现阳性反应条带，说明野生型αsynuclein蛋白及突变体A30P、E46K和A53T都成功展示在大肠杆菌的细胞表面。图3 αsynuclein蛋白 WT、A30P、E46K和A53T展示情况分析

　　3 讨 论

　　随着分子生物学研究的突飞猛进，定点突变技术成为重要的实验技术手段之一，在生物学和医学领域中有着非常广泛的应用。通过改变编码特定氨基酸的碱基，获得突变型蛋白，用于研究蛋白质的结构与功能;同时可以用来获得一些资源比较稀有难以直接克隆得到的突变型基因。PCR介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法之一，主要包括大引物突变法〔12〕、重叠延伸突变法〔13〕等。其中叠套PCR可以在DNA区段的任何位置突变，且可以在引物的两端引入酶切位点，方便进一步的亚克隆。

　　αsynuclein是一种与帕金森病密切相关的小蛋白，在帕金森病家族病史的家族成员中存在A30P、E46K和A53T 3个天然突变体。近几年来，关于αsynuclein蛋白纤维化过程的生物物理学研究发现，在αsynuclein纤维化的过程中会形成一类被称为初原纤维的寡聚体，这类寡聚体在形成过程中，一般先形成包含20～30个αsynuclein分子的圆状结构;随后彼此聚合形成链状结构，最终转化为稳定的纤维状结构〔14，15〕，而αsynuclein的突变蛋白A30P、E46K和A53T与αsynuclein蛋白的聚集状态和聚集速度密切相关。研究表明突变体A30P及A53T突变型蛋白与野生型蛋白相比，在体外均可以促进寡聚体的形成，而A30P在随后形成纤维状结构的速率上则比野生型和A53T突变慢〔16〕。实际上，我们在美国UAB病理系神经生物学张建华实验室开展的工作中也已经发现，在神经瘤母细胞SHSY5Y细胞株的Western检测中，确实存在单体和多聚体αsynuclein聚集的事实。本文利用叠套PCR技术，以野生型αsynuclein为模板，构建了αsynuclein3个突变基因，结合生物信息学分析，发现A30P、E46K和A53T的突变位点位于αsynuclein的不同区域，A30P和A53T位于螺旋处，而2004年Zarranz发现的E46K则位于转角处，由一个酸性的谷氨酸突变为碱性的赖氨酸〔10〕，这可能是αsynuclein执行生物学功能的一个关键位点。由此可以推断A30P、E46K和A53T这3个突变位点可能通过不同的方式来影响αsynuclein的聚集状态和聚集速度。

　　细菌表面展示是继噬菌体表面展示之后发展起来的一种新的细胞展示技术，在靶分子药物筛选、疫苗、生物吸附剂以及分子间相互作用等领域具有广泛的应用价值。目前利用的展示载体主要包括细菌外膜蛋白，脂蛋白和自转运蛋白等。亲密素细菌展示系统是Wentzel等于2001年利用大肠杆菌表面蛋白亲密素能够特异地与细胞表面受体相结合的特性，通过C端与外源蛋白的融合来实现外源蛋白展示的一种新型细菌展示系统，其具有转运较大分子量的蛋白、保持细胞膜稳定的结构和外源蛋白的生物学功能等优点〔17〕。为此，我们在成功克隆αsynuclein3种突变体的基础上，又利用大肠杆菌表面蛋白亲密素展示系统将其展示在大肠杆菌表面，本工作对于进一步的基于αsynuclein神经退行性疾病靶向分子药物、分子诊断试剂的研发和蛋白结构功能研究等具有重要的意义和价值。

参考文献

　1 Maroteaux L，Scheller RH.Synuclein:a neuronspecific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal〔J〕.J Neurosci，1988;8(8)：280415.

　　2 Gasser T.Genetics of Parkinson′s disease〔J〕.J Nurol，2001;248(10)：83340.

　　3 Waxman EA，Giasson BI.Molecular mechanisms of αsynuclein neurodegeneration〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1792(7)：61624.

　　4 杨 玲，杨 慧.αsynuclein聚集与帕金森病影响αsynuclein蛋白聚集的因素〔J〕.生物化学与生物物理进展，2006;33(4)：3218.

　　5 Kragh CL，Lund LB，Febbraro F，et al.αsynuclein aggregation and Ser129 phosphorylation dependent cell death in oligodendroglial cells〔J〕.J Biol Chem，2009;284(15)：1021122.

　　6 Ostrerova N，Petrucelli L，Farrer M，et al.Alphasynuclein shares physical and functional homology with 133 proteins〔J〕.J Neuro Sci，1999;19(4)：578291.

　　7 Chandra S，Gallardo G.Alphasynuclein cooperates with Cspalpha in prevebting neurogegeneration〔J〕.Cell，2005;23(3)：38396.

　　8 Polymeropolos MH，Lavedan C，Letoy E.Mutation in the alphasynuclein gene identified in families with Parkinson′s disease〔J〕.Science，1997;276(5321)：24057.

　　9 Kruger R，Kuhn W，Muller T，et al.Ala30Pro mutation in the gene encoding alphasynuclein in Parkinson′s disease〔J〕.Nat Genet，1998;18(2)：1068.

　　10 Zarranz JJ，Alegre J，GomezEsteban JC，et al.The new mutation，E46K，of αsynuclein causes parkinson and lewy body dementia〔J〕.Ann Neurol，2004;55(2):16473.

　　11 Hu HY，Lin XJ.Molecular mechanism of abnormal aggregation of αsynuclein〔J〕.Chin Sci Bulletin，2007;52(2)：15964.

　　12 Wentzel A，Christmann A，Adams T，et al.Display of passenger proteins on the surface of escherichia coli K12 by the enterohemorrhagic E.coli intimin eaeA〔J〕.J B cteriol，2001;24(183)：727384.

　　13 Ke SH，Madison EL.Rapid and efficient sitedirected mutagenesis by singletube megaprimer PCR method〔J〕.Nucleic Acids Res，1997;25(16)：33712.

　　14 Urban A，Neukirchen S，Jaeger KH.A rapid and efficient method for sitedirected mutagenesis using onestep overlap extension PCR〔J〕. Nucleic Acids Res，1997;25(11)：22278.

　　15 Conway KA，Lee SJ，Rochet JC，et al.Acceleration of oligomerization，not fibrillization，is a shared property of both alphasynuclein mutations linked to early onset Parkinson ′s disease：implications for pathogenesis and therapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(2)：5716.

　　16 Bosco D，Fowler DM，Zhang Q，et al.Elevated levels of oxidized cholesterol metabolites in Lewy body disease brains accelerate alphasynuclein fibrilization〔J〕.Nat Chem Biol，2006;2(5)：24953.

　　17 Conway KA，Harper JD，Lansbury PT.Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alphasynuclein linked to early onset Parkinson disease〔J〕.Nat Med，1998;4(11)：131820.