川芎嗪抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

【摘要】 目的 观察川芎嗪注射液对血小板源性生长因子 (PDGF) 诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖过程中黏附分子信号传递的影响，以明确川芎嗪活血化瘀作用的新靶点。方法 采用贴块法培养VSMC，建立PDGF诱导的VSMC增殖模型，用细胞计数法观察不同浓度川芎嗪对VSMC增殖的抑制作用。用Western印迹方法分别检测各组细胞间黏附分子(ICAM1)及黏附分子信号传递蛋白——整合素耦联激酶 (ILK) 的表达变化及川芎嗪影响。结果 与PDGF刺激组相比，川芎嗪呈剂量依赖性地抑制PDGF诱导的细胞增生，并显著降低ICAM1〔仅相当于刺激组的44%，(P&<0.05)〕及ILK〔仅相当于刺激组的62%，(P&<0.05)〕的表达。结论 川芎嗪通过抑制黏附信号传递及黏附分子的表达而发挥抗VSMC增生的作用。

【关键词】 川芎嗪注射液;黏附分子;信号转导;血管平滑肌细胞

　　【Abstract】 Objective To investigate the Tetramethylpyrazine (TMP)mediating antiproliferation effect，and define its molecular mechanism in cultured rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Cultured cells proliferating model of rats VSMC were established by plateletderived growth factor (PDGF). Cultured cells were randomly pided into three groups: control， PDGF (20 ng/ml)and TMP treatment (20， 40， 80 μmol/L) groups. The number of VSMC were accounted under microscope. The expression of intercellular adhesion molecular1 (ICAM1) and integrinlinked kinase (ILK) were analyzed by Western blotting respectively. Results The proliferation of rat VSMC induced by PDGF could be inhibited by TMP significantly in a dosedependent manner. A remarkable decrease of ICAM1 and ILK expression were demonstrated in the TMP group compared with the PDGF group.Conclusions The antiproliferation effect of TMP associates with suppression of adhesive molecules.

　　【Key words】 TMP;Adhesive molecules;Signal transduction;Vascular smooth muscle cells (VSMC);Rat

　　川芎嗪是从具有活血化瘀作用的中药川芎中分离得到的一种生物碱，化学组分为四甲基吡嗪，目前已在临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗。我们前期研究证明，川芎嗪通过作用于血管平滑肌细胞(VSMC)而发挥活血化瘀的作用〔1〕，但缺乏在分子水平上阐明其机制的研究。细胞间黏附分子(ICAM)是一类介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的膜表面糖蛋白，在单核细胞及血小板的黏附聚集过程中发挥着重要的作用，与细胞增殖密切相关〔2〕。本研究用血小板源性生长因子(PDGF)刺激体外培养的大鼠VSMC复制细胞异常增殖模型，从抑制黏附分子信号传递角度探讨川芎嗪抗VSMC增殖的机制，为从分子水平上阐明其活血化瘀作用机制提供实验依据，明确其作用靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康雄性5周龄SD大鼠，体重(100±10)g，由河北省实验动物中心提供。川芎嗪注射液 (40 mg/2 ml)由北京第四制药厂提供。DMEM培养基、胎牛血清FBS由Gibco公司提供。PDGF、小鼠抗ICAM1单克隆抗体、小鼠抗整合素耦联激酶(ILK)单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗、发光试剂等均购自美国Santa Cruz公司。其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2 VSMC的培养 5周龄雄性SD大鼠用25%乌拉坦按照0.4 ml/100 g体重进行腹腔注射麻醉，于无菌条件下取大鼠的胸腹主动脉。用0.01 mol/L PBS洗净管腔内血液并剥脱血管外膜后，按贴块法分离培养VSMC。待细胞爬满培养瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，用光镜及免疫组化的方法进行细胞鉴定。取3～6代细胞进行实验。

　　1.3 细胞分组 取传代培养的VSMC接种于细胞培养瓶中。待VSMC在含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长至60%～70%融合时，换无血清培养基饥饿培养24 h，使细胞同步化于静止期。实验随机分为对照组、PDGF刺激组和川芎嗪组。对照组单纯加入培养液5 ml;PDGF刺激组添加PDGF使其终浓度为20 ng/ml;川芎嗪组先用不同浓度 (20、40、80 μmol/L) 的川芎嗪注射液预孵育1 h，然后再加PDGF(20 ng/ml) 刺激24 h。收集各组细胞进行实验。

　　1.4 Western印迹分析 提取各组细胞的蛋白，用改良的Lowry法测定浓度。取各组等量蛋白提取液经8% SDSPAGE电泳分离后，半干式电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别与鼠抗ICAM1单克隆抗体 (1∶300)、ILK单克隆抗体(1∶400) 在4℃条件下封闭反应过夜。用HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000) 室温反应2 h，经TTBS、TBS充分洗涤后采用化学发光法显影。用美国Kodark公司ID数码成像分析系统分析结果。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS10.0 统计软件包处理，数据以x±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 川芎嗪呈剂量依赖性抑制VSMC的增殖 细胞计数后发现，与对照组比较，PDGF刺激组细胞数量显著增多，增加约3.8倍。20 μmol/L川芎嗪实验组对细胞数目增加的抑制作用不明显，40 μmol/L川芎嗪组具有抑制细胞数量的作用，此时细胞数量约为PDGF刺激组的48%(P&<0.05)。80 μmol/L川芎嗪组抑制细胞数量的作用更明显，细胞数量为PDGF刺激组的33%(P&<0.05)，选择80 μmol/L的川芎嗪进行后续实验。

　　2.2 川芎嗪抑制ICAM1的表达 Western印迹结果经过灰度值对比处理后发现，正常对照组ICAM1的灰度值表达量很小，PDGF刺激组ICAM1的表达量显著增加。川芎嗪组ICAM1的表达量与刺激组相比明显减少，仅相当于其的44%(P&<0.05)，见图1。图1 ICAM1和Western印迹检测结果

　　2.3 川芎嗪抑制ILK的表达 Western印迹结果显示，对照组仅有少量ILK表达;PDGF刺激组ILK的表达量明显增加。川芎嗪组ILK的表达量虽然仍旧比对照组多，但与PDGF刺激组相比降低明显，仅相当于其62%(P&<0.05)。ILK在各组中的变化谱型与ICAM1的改变趋势具有一致性，见图2。图2 ILK Western印迹检测结果

　　3 讨 论

　　川芎嗪是伞形科植物川芎的主要成分，具有活血化瘀的作用，因可与其他中药组成方剂，故广泛应用于心脑血管疾病的救治。大量研究表明川芎嗪可抑制VSMC的异常增殖，但对其确切的分子机制目前尚不很清楚。现已明确，动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的主要病变特征是血管平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖、血小板的黏附聚集、单核/巨噬细胞浸润等，黏附分子及其受体的相互作用是引发这一系列慢性炎症过程的主要生物学机制。因此，如何抑制黏附分子的表达或阻断其功能已经成为研制抗血管增殖性疾病的新靶标〔3〕。

　　单核细胞在血管内皮黏附并向内皮下迁移和泡沫化被认为是动脉粥样硬化的早期病理过程。ICAM1是单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，分子量为80～110 kD，其受体为整合素家族的黏附分子白细胞功能相关抗原1(LFA1)。已经发现ICAM1/LFA1的相互作用在淋巴细胞与内皮细胞的相互作用、淋巴细胞介导的细胞毒反应过程中具有至关重要的作用〔4〕。ICAM1可分布于白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞上，正常情况下很少或不表达，在炎症、内皮损伤等病理生理条件下表达增加，从而促进炎症的发生与发展〔5〕。所以阻断黏附分子的作用可能会抑制细胞的迁移与增殖。本研究结果显示，对照组ICAM1很少表达，这可能是由于此时 VSMC 正处于分化状态不具有增殖活性，PDGF刺激组由于细胞异常增生活跃，故 ICAM1 的表达量明显增多，川芎嗪组 ICAM1 的表达量与比PDGF刺激组相比显著减少，提示川芎嗪可能通过抑制ICAM1的表达而发挥抗VSMC增殖的作用。

　　ILK是1996年Hannigan等〔6〕用酵母双杂交的方法研究整合素β1结合蛋白的过程中被发现的。它具有Ser/Thr蛋白激酶结构，是一个59 kD的细胞内信号蛋白，广泛分布于多种细胞中，对黏附分子信号跨膜转导至细胞内起者关键性的介导作用。ILK可以与整合素β1、β2、β3亚基胞浆区域及细胞骨架相关蛋白结合，以依赖于PI3K的方式被激活。活化后的ILK可以磷酸化蛋白激酶B (PKB) 的Ser473和糖原合成酶激酶3 (GSK3)，进而发挥生物学效应。ILK在调节细胞黏附与生长、肿瘤形成等过程中均起重要作用，是保证黏附信号进一步向下游传递的重要调节分子。为了探讨川芎嗪抑制ICAM1表达的生物学意义，本研究进一步观察了ILK在增殖细胞中的表达变化。Western印迹结果显示，作为黏附分子信号传递关键性调节激酶的ILK在各个实验组中的变化趋势与ICAM1的改变基本相同。以上结果提示，川芎嗪可能通过下调ILK的表达得以阻断细胞黏附与迁移的信号在VSMC内的传递;通过减少ICAM1的表达减弱炎细胞的黏附与聚集，从而削弱局部的炎症反应，起到抑制细胞异常增殖的作用。

　　总之，本研究结果提示川芎嗪可逆转由PDGF刺激导致的VSMC异常增殖，其分子机制与阻断黏附分子信号传递、抑制黏附分子表达有关。由于中药具有多层次多靶点作用的特点，川芎嗪是否还通过其他途径抑制VSMC异常增殖还需做进一步的探讨。

参考文献

　　1 狄柯坪，常立功.川芎嗪对家兔肠系膜微血管运动的作用机理与一氧化氮的关系〔J〕.中成药，2003;25(1)：4951.

　　2 高 岩，夏 蕾，白 明.实验性大鼠肺血栓栓塞症中ICAM1，P选择素的变化及当归注射液的影响〔J〕.中国微循环，2007;11(3)：1769.

　　3 Shimizu N，Suzuki H， Wakabayashi K，et al.Expression of intercellular adhesion molecule1 and vascular cell adhesion molecule1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation〔J〕.J Cardiol，2004;43(3)：1319.

　　4 Smith LA，Helim AE.Interplay between shear stress and adhesion on neutrophil locomotion〔J〕.Biophys J，2007;92(2)：63240.

　　5 Lindsberg J，Carpen O，Paetau A，et al.Endothelial ICAM1 expression associated with inflammatory cell response in human ischemic stroke〔J〕. Circulation，1996;94(5)：93945.

　　6 Hannigan GE，LeungHagesteijn C，Gibbon FL，et al.Regulation of cell adhesion and anchoragedependent growth by a new β1integrinLinlced protein kinase〔J〕.Nature，1996;379(6560):916.