小鼠Foxp3抗血清的制备及应用

　　　　 作者：焦海春， 肖建华*， 何涛君， 胡杰， 崔彦芬

【摘要】 　　目的: 制备高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清， 并初步应用于正常小鼠组织的Foxp3表达的鉴定。方法: 构建重组质粒pGEX6p2/Foxp3， 并转化至E.coli BL21(DE3)中进行大量诱导表达， 用纯化的重组融合蛋白免疫新西兰兔， 制备抗血清。以制备的抗血清为一抗， Western blot检测小鼠组织的Foxp3蛋白的表达。结果: SDSPAGE及Western blot鉴定， 诱导表达及纯化的重组融合蛋白能被抗GST单克隆抗体（mAb）识别， 在Mr 45000附近有特异条带， 与预期融合蛋白大小一致， 获得的抗血清效价在1∶12800以上， 该抗血清能特异性识别NIH3T3细胞中表达的Foxp3蛋白。Western blot鉴定结果显示在脾脏、 胸腺、 淋巴结中Foxp3蛋白有较高表达， 胃也有少量的表达， 而骨骼肌、 脂肪组织未见表达。结论: 制备了高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清， 并可用于正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定， 为进一步研究Foxp3奠定了实验基础。

【关键词】 Foxp3 CD4+CD25+Treg细胞 抗血清制备

　　[Abstract] AIM: To prepare the high titer and specific antiserum against mouse Foxp3 and then use them to identify Foxp3 expression in normal mouse tissues. METHODS: The Foxp3 fragment was amplified by polymerase chain reactions(PCR) and cloned into the prokaryotic expression vector pGEX6p2. The recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 was transformed into E.coli BL21(DE3) to be expressed. The expressed fusion protein GSTFoxp3 was analyzed by SDSPAGE and Western blot. The polyclonal clantiserum was obtained by immunizing New Zealand rabbits with the purified fusion protein as antigen. The Foxp3 expression in normal mouse tissues was detected by Western blot with the antiserum. RESULTS: The expressed products were analyzed by SDSPAGE and Western blot. The results showed that the molecular weight of the expressed protein was about 45 000. The titer of the antiserum was above 1∶12 800. We observed that the antiserum could recognize Foxp3 protein expressed in NIH3T3 cells by immunoblotting. Western blot results showed that the Foxp3 protein was expressed highly in spleen， thymus and lymph nodes， less expressed in stomach， but not expressed in skeletal muscle and adipose tissue. CONCLUSION: High titer antiserum against mouse Foxp3 is produced and can be used to identify the Foxp3 expression in normal mouse tissues.

　　[Keywords]Foxp3; CD4+CD25+Treg cell; antiserum preparation

　　1995年， Sakaguchi等[1]发现CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（regulatory T cell， Treg）后， 该细胞的研究成了近年来免疫学领域的研究热点之一。人们发现， Treg在自身免疫病、 抗感染免疫、 肿瘤免疫、 移植物耐受等方面都具有重要意义。Foxp3基因属于转录因子forkhead/wingedhelix家族， 该基因家族由大量分布极广的转录因子组成， 该家族成员具有共同的保守序列“叉状头/翅膀状螺旋”DNA结合域。在Scurfy小鼠和人类IPEX综合征（immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy， Xlinked syndrome）中发现Foxp3基因的突变， Scurfy小鼠和IPEX中均出现Treg的数量及功能异常[2]。2003 年，研究证明转录因子Foxp3不仅在Treg上特异性表达， 而且对Treg的发育和功能是必需的[3， 4]。O’Garra等[5]称其为21世纪分子， 可以知道其在免疫调节中起到不可忽视的作用。目前对转录因子Foxp3的研究还处于初级阶段， 对其在体内的作用， 尤其是分子效应机制方面了解还甚少。因此， 我们制备了高效价的特异性小鼠抗Foxp3血清， 并对正常小鼠组织进行了检测， 对制备的抗血清进行了初步应用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pGEX6p2表达载体、 E.coli BL21、 E.coli XL1blue、 NIH3T3 细胞、 GST纯化蛋白为本研究所保存。pMIGR1/Foxp3重组质粒和pMIGR1质粒由Sakaguchi S教授(Kyoto University， Japan)赠送。纯种雄性新西兰兔、 清洁级昆明小鼠为南华大学动物部饲养。限制性内切酶EcoR I和Xhol I、 T4 DNA连接酶、 Taq酶、 DNA标准购自Fermentas公司; P7708V蛋白质标准为纽英伦公司产品; GST琼脂糖凝胶FF纯化柱购自北京天来公司; 弗氏佐剂购自Sigma公司; ECL增强化学发光试剂盒购自PIERCE公司; 引物由上海生工技术服务公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抗原表位的选择 从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)中获取小鼠Foxp3基因(NM: 054039)的碱基序列及氨基酸序列， 用ExPasy网上软件作抗原表位分析(网址: www.ExPasy.org)， Blast软件分析选取与Foxp家族(Foxp1、 Foxp3、 Foxp2、 Foxp4)中的其他成员相比较特异的一段氨基酸序列， 综合以上指标， 选择抗原性较强的抗原表位区Foxp3区段(178～336aa)的编码基因片段(532～1008bp)为目的基因。

　　1.2.2 目的基因的PCR扩增 根据基因库提供的Foxp3编码基因序列， 设计特异性扩增引物。上游引物P1: 5′CCGAATTCGGAAAGACCCAGCCAACCTT3′， 引入EcoR I酶切位点; 下游引物P2: 5′GGCCTCGAGCATATTGTGGTACTTGAAG3′， 引入Xhol I酶切位点。以pMIGR1/Foxp3重组质粒为模板， PCR扩增目的基因， 94℃ 5 min预变性后， 进入94℃ 30 s， 61℃ 45 s， 72℃ 45 s的循环， 共计30次， 末次循环后72℃延伸7 min终止反应。产物经10 g/L琼脂糖电泳鉴定， 通过DNA纯化系统回收。

　　1.2.3 PCR产物的亚克隆 纯化回收的PCR产物经限制性内切酶EcoR I和Xhol I双酶切消化， 再次纯化回收后，　　亚克隆到经同样的双酶酶切消化然后纯化回收的原核表达载体pGEX6p2上。经PCR筛选， EcoR I酶和Xhol I酶双酶切鉴定后核苷酸序列测序鉴定。

　　1.2.4 重组融合蛋白的表达、 纯化及鉴定 取500 mL IPTG（终浓度为0.1 mmol/L） 20℃诱导6 h的菌液离心收集菌体， 加入细胞裂解液， 反复冻融后超声破菌， 离心收集上清， 用GST琼脂糖凝胶FF纯化柱纯化。采用紫外吸收法测定纯化蛋白浓度， 并进行SDSPAGE分析。以鼠抗人GST mAb为一抗， Western blot鉴定重组融合蛋白。 Western blot鉴定参照《分子克隆实验指南》（第3版）实验技术进行。

　　1.2.5 兔抗小鼠Foxp3多克隆血清的制备 选质量4.0 kg的雄性新西兰兔， 于背部皮下多点注射纯化的重组融合蛋白500 μg， 共4次， 同时设GST、 PBS对照组为阴性对照。第1次加等量完全弗氏佐剂， 后3次加入等量不完全弗氏佐剂， 每次间隔10 d。第4次免疫10 d后耳缘静脉采血， 离心分离血清， 检测血清特异性抗体， 并测定血清抗体滴度（免疫前的血清作为阴性对照）， 若抗体效价达到要求， 心脏采集兔全血， 离心分离血清， 并加入纯化的GST蛋白以封闭血清中的GST抗体， 分装成小份保存于-20℃待用。

　　1.2.6 兔抗小鼠Foxp3血清的特性鉴定 (1)效价测定: 采用ELISA法， 用纯化的GSTFoxp3重组融合蛋白包被酶标板， 4℃包被过夜， 兔血清稀释度从1∶100到1∶51200， 羊抗兔IgGHRP(1∶10000稀释)为二抗， 四甲基联苯胺(TMB)显色， 酶标仪检测A450值， 以免疫前兔血清作阴性对照， 结果以待测标本A450值/阴性对照A450值≥2.1为阳性， 以出现阳性反应的最高稀释度作为血清的效价。(2)特异性鉴定: 利用电穿孔法分别转染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3细胞， 提取转染细胞的总蛋白， SDSPAGE分析， 蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。Western blot鉴定， 一抗为兔免疫血清（1∶1000稀释）， 二抗为HRP标记的羊抗兔IgG（1∶4000稀释）， 发光法检测NIH3T3转染细胞表达的Foxp3蛋白。

　　1.2.7 正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定 提取昆明小鼠脾脏、 胸腺、 腹股沟淋巴结、 胃、 骨骼肌、 脂肪组织的总蛋白， 以处理的小鼠Foxp3抗血清为一抗进行Western blot鉴定。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pGEX6p2/Foxp3的鉴定 构建的重组质粒经EcoR I和Xhol I双酶切及PCR鉴定， 结果经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析可见， 酶切后出现了质粒大片段和477 bp左右的小片段， 以重组质粒为模板的PCR扩增亦得到了477 bp左右的片段， 与目的片段大小相符（图1）。序列测定结果与GenBank上序列(NM054039)完全一致。

　　图1 重组质粒pGEX6p2/Foxp3的酶切及PCR鉴定（略）

　　Fig 1 Identification of recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 with restrictive enzyme digestion and PCR

　　1: DNA marker; 2: Amplified fragment from pGEX6p2/Foxp3; 3: Recombinant plasmid pGEX6p2/FOXP digested by EcoR I and Xhol I; 4: Plasmid pGEX6p2 digested by EcoR I and Xhol I; 5: Recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3; 6: Plasmid pGEX6p2; 7: DNA marker.

　　2.2 重组蛋白的表达及纯化 按GST琼脂糖凝胶FF说明书纯化重组诱导菌的超声裂解上清， 得到的洗脱液进行SDSPAGE后， 在胶上只见单一的蛋白条带， 位于Mr 45000蛋白带附近（图2）。

　　2.3 重组蛋白表达及纯化的Western blot鉴定 IPTG诱导后重组菌在Mr约为45000处有阳性反应条带， 而未诱导的重组菌菌则无阳性反应条带， 此反应条带与SDSPAGE新增的条带在同一位置; 纯化蛋白在约Mr 45000处亦可见一阳性反应条带（图3）。

　　图2 重组蛋白纯化的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 2 SDSPAGE analysis of purification of the recombination protein

　　1: Protein marker; 2: Noninduced bacteria with pGEX6p2/Foxp3 at 20℃ by IPTG; 3: Induced bacteria with pGEX6p2 at 20℃; 4: Induced bacteria with pGEX6p2/Foxp3 at 20℃; 5: Supernatant of broken induced bacteria with pGEX6p2/Foxp3 at 20℃; 6: Hybridprotein washed with buffer solution 1; 5: The purified recombination protein.

　　图3 Foxp3重组蛋白的Western blot鉴定（略）

　　Fig 3 Western blot analysis of recombinant protein

　　1: Purified recombinant protein; 2: Induced bacteria with pGEX6p2/Foxp3 by IPTG; 3: Noninduced bacteria with pGEX6p2/Foxp3.

　　2.4 兔抗小鼠Foxp3血清的特性鉴定 (1)用纯化蛋白免疫新西兰兔4次后， ELISA法检测抗血清的效价均达到1∶12800以上， 血清阳性反映率为6/6。对照组新西兰兔（PBS组和GST组）经4次免疫后， 血清中未检出Foxp3特异性抗体或滴度很低; (2)特异性鉴定: Western blot分析该抗血清能和NIH3T3细胞中表达的Foxp3蛋白特异性的结合（图4）。

　　图4 Western blot分析NIH3T3细胞中Foxp3的表达（略）

　　Fig 4 Western blot analysis of the Foxp3 expression in NIH3T3 cells

　　1， 2: NIH3T3 cells with pMIGR1/Foxp3; 3: NIH3T3 cells with pMIGR1.

　　2.5 正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定 Western blot鉴定结果显示在脾脏、 胸腺、 淋巴结中Foxp3有较高表达， 胃也有少量的表达， 而骨骼肌、 脂肪组织未见表达（图5）。

　　图5 Western blot分析正常小鼠组织中Foxp3的表达（略）

　　Fig 5 Western blot analysis of the Foxp3 expression in normal mouse tissue

　　1: Stomach; 2: Skeletal muscle; 3: Spleen; 4: Thymus; 5: Lymph node; 6: Adipose tissue.

　　3 讨论
　　
　　本研究中利用PCR技术扩增出了抗原性强且较特异的Foxp3区段(178～336aa)的基因编码片段， 同时选用pGEX6p2原核表达载体， 成功地构建了pGEX6p2/Foxp3重组质粒; 通过对重组质粒进行的酶切、 PCR鉴定和进一步的核苷酸序列分析， 证实了插入序列与靶基因的一致性以及读码框架正确， 确保了下一步研究的可靠性。原核表达载体pGEX6p2有利于重组融合蛋白的可溶性表达， 我们在低温20℃下获得了目的蛋白的可溶性表达， 这一状态易于蛋白的纯化[6]。诱导表达及纯化的重组融合蛋白， 经SDSPAGE电泳， 显示位于Mr 45000处， 与理论值相符。用抗GST标签的mAb， Western blot检测发现诱导全菌及纯化的蛋白均可以与该抗体特异性结合， 说明我们成功地获得了目的蛋白的表达并得到了高纯度的重组融合蛋白。GST本身Mr约为26000， 具有一定的免疫原性。因此在用重组融合蛋白免疫动物时， GST可能会有一定干扰。我们在免疫动物时， 用GST和PBS免疫动物作为对照组， 并加入了纯化的GST蛋白封闭了血清中的GST抗体， 排除了GST对重组蛋白抗血清滴度的影响。经间接ELISA法检测抗血清的效价在1∶12800以上， 说明表达的重组蛋白具有很好的免疫原性。通过Western blot分析， 抗血清和能和小鼠Foxp3蛋白特异性的结合， 具有较好的特异性。我们进一步将制备的抗血清应用于正常小鼠组织的Foxp3表达的鉴定， 发现Foxp3在含大量T淋巴细胞的脾脏、 胸腺、 淋巴结有较高表达， 含少量T淋巴细胞的胃组织也有一定量的表达， 而骨骼肌、 脂肪组织未见表达。这一结果与Foxp3的表达局限于T淋巴的细胞一致。所以， 我们制备了高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清， 并可用于正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定， 为进一步研究Foxp3奠定了实验基础。

参考文献

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　　[2] Fontenot JD， Gavin MA， Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J]. Nat Immunol， 2003， 4(4): 330-336.

　　[3] Khattri R， Cox T， Yasayko SA， et al. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ regulatory T cells[J]. Nat Immunol， 2003， 4(4): 337-342.

　　[4] Hori S， Nomura T， Sakaguchi S. Control of regulatory T cells development by the transcription factor Foxp3[J]. Science， 2003， 299(5609): 1057-1061.

　　[5] O’Garra A， Vieira P. Twentyfirst century Foxp3[J]. Nat Immunol， 2003， 4(4): 304-306.

　　[6] 周 敏， 杨 芳， 贺智敏， 等. 人金属硫蛋白MT22a的原核表达、 纯化及其抗血清的制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(4): 530-532.