特异siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPCl细胞生长的实验研究

【摘要】 目的：研究Slug基因沉默对胰腺癌AsPCl细胞增殖、凋亡的影响。方法：构建靶向抑制S1ug的siRNA表达载体，瞬时转染AsPC1细胞。采用RTPCR和Westernblot法检测细胞Slug蛋白，MTT检测细胞增殖，Annexin VFITC/PI了解细胞凋亡的变化。结果：成功构建了pGenesillSlugsiRNA(pSlugsiRNA)和pCenesil1NegsiRNA(pNegsiRNA)表达质粒。pSlugsiRNA瞬时转染AsPC1细胞72 h后，细胞S1ug表达及生长受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加。结论：SlugsiRNA抑制Slug表达，促进AsPC1细胞凋亡并抑制细胞的增殖。

【关键词】 Slug：小干扰RNA;瞬时转染;增殖：凋亡;胰腺肿瘤;AsPC1

　　[ABSTRACT] Objective: To inhibit Slug expression in pancreatic cancer cells with small interfering RNA(siRNA)，and explore its effect on cell proliferation and apoptosis. Methods：Plasmaid S pSIugsiRNA and pNegSiRNA(negative control) were constructed and transfected into AsPC1 cells. The expression of Slug was detected by RTPCR and Western blotting. The proliferation of CaPan2 cells in vitro was determined by MTT assay. The apoptotic rates of the cells were detected by flow cytometry. Results：Two cell clones were screened from pSlugsiRNA and pNegsiRNAtransfected AsPC1 cells. Slug expression in AsPC1 cells was suppressed markedly after transfection of pSlugsiRNA. The apoptosis rate was significantly higher in pSlugsiRNA cells than in pNegsiRNA cells. Apoptosis could be seen more easily by Hoechst 33258 and PI staining at 72h in pSlugsiRNA cells than in pNegsiRNA and control cells.Conclusion：Slug inhibition can inhibit the proliferation of AsPC1 cell in vitro， and accelerate the apoptosis.

　　[KEY WORDS] Slug; Small interfering RNA; Transfection; Proliferation;Apoptosis; Pancreatic carcinoma; AsPC1

　　最初发现，Slug是转录因子SNAIL家族中编码锌指蛋白的基因，参与神经胚的形成与神经干的正常发育[1]。后来发现[2]Slug在恶性肿瘤中过度表达，并与肿瘤的发生、发展，患者预后有关。最近发现，S1ug是PUMA的强烈抑制基因[3]，而PUMA是促凋亡基因，因此，干扰Slug可能解除Slug对PUMA的抑制，促进细胞凋亡并抑制细胞生长。本文旨在研究S1ug基因沉默后对胰腺癌AsPC1细胞的增殖和凋亡的影响，探讨胰腺癌基因治疗的新靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和试剂

　　人胰腺癌细胞株AsPC1购自中科院上海细胞所、pGenesill质粒购自Austin，USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamH I、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品;Slug多克隆抗体及G3PDH抗体为Santa Cruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品，凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，siRMA的转录模板由上海生工合成，合成的DNA合成片段序列为：

　　Sluglsense

　　5tgcaaatgtacccaatgatattcaagagatatcattgggtacatttgcttttttC3

　　Sluglantisense

　　5tcgagaaaaaagcaaatgtacccaatgatatctcttgaatatcattgggtacatttgca3

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒的构建 合成的siRNA转录模板序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个TTTTT作为终止序列，上游和下游分别加了BamH I、Hind III酶切位点，pGenesil1质粒经BamH I、Hind lII酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接(160 ℃8 h)，转化DH5α菌株，涂卡那霉素琼脂平板，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamH I、Hind Ⅲ双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送 Invitrogen 公司测序，测序引物为5'caaggtcgggcaggaagag3'，测序正确后大量提取质粒。

　　1.2.2 细胞培养 细胞用含10%胎牛血清的RPMRl640培养基培养，细胞培养条件为37 ℃恒温，饱和湿度和5%CO2，每2～3天传代一次，指数生长的细胞为实验对象。

　　1.2.3 细胞瞬时转染 在6孔培养板中常规接种AsPC1细胞，待细胞70%～80%融合后，经LipofectamineTM2000介导质粒转染AsPC1细胞72 h(按试剂盒说明操作)。

　　1.2.4 AnnexinVFITC/PI染色 收集3组细胞，每组设3个复孔。用去离子水按1∶4稀释结合缓冲液。用4 ℃预冷的1×PBS洗细胞2次，用250 g结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为l×106/mL。取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μLAnnexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的PI溶液。混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加入400 μLPBS，混匀，流式细胞仪(FACS)分析，激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。

　　1.2.5 MTT测定 取对数生长期的3组细胞用0.25%TrypsinEDTA消化成单细胞悬液接种于96孔培养板，104细胞/孔，每孔加入200 μL含10%FBS的高糖DMEM液，分别培养0，12，24，36，48，72 h，每组设3个复孔。在每个时间点加入5 mg/mL的MTT液(20 μL/孔)，继续培养4 h，培养条件同上。吸出孔内培养液后，加入DMSO液(150 μL/孔)，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测各孔A570°值，绘制连续5 d的细胞生长曲线，实验重复3次。

　　1.2.6 WesternBlot检测蛋白的表达 按说明书方法进行操作，提取细胞总蛋白进行WesternBlot检测。SDSPAGE分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%，上样量为45 μg;SDS电泳:恒流，每块板20～40 mA，电泳时间约2 h;转膜:恒流，每张膜42 mA，时间:3.5 h。

　　1.2.7 RTPCR 按TRizol试剂盒(1nvitrogen公司)说明书操作提取不同组细胞总RNA，取1 μg RNA模按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。引物序列Slug(414 bp)：R:5'CGTCACGACGGGTCAGAT3'，F:5'ATCTGACCCGTCGTGACG3'，反应条件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸7 min，28循环。以上引物由赛百盛公司合成。取5 μL反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用SYNGENE型凝胶成像系统照像，以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量，实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　采用SAS 9.0统计软件进行统计学处理，数据以(±s)表示。组间均数的比较采用SNKq检验或配对t检验，检验水准a=0.05。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒载体PCR鉴定

　　结果显示，仅加ddh30的阴性对照未见条带，加入空载体的阴性对照可见条带，大小约为300 bp左右，加入插入片段载体的阳性对照和加入插入片段的载体的鉴定组可见条带，大小约为364 bp左右，略大于阴性对照的条带。载体的双链DNA片段已正确插入到质粒载体中(图1)。测序结果证明，质粒的目的DNA片段已正确克隆入载体。

　　2.2 SlugsiRNA抑制Slug基因和蛋白表达

　　Slug检测发现，AsPC1/pSlugsiRNA细胞内S1ug蛋白和SlugmRNA表达已被显著抑制，而AsPCl pNegsiRNA细胞内Slug蛋白和SlugmRNA表达无明显变化，提示SlugsiRNA 抑制了细胞内Slug的表达(图2，3)。

　　2.3 MTT检测

　　AsPCl/pSlugsiRNA和AsPCI/pNegsiRNA两组细胞生长能力差异无统计学意义(P&>0.05)。而实验组细胞的生长能力较低，细胞增殖明显滞后于前两组细胞，差异有统计学意义P&<0.05)(图4)。

　　2.4 Annexin VFITC/PI检测

　　FCM显示转染72 h后，AsPC1/pSltugsiRNA和AsPC1/pNegsiRNA细胞的凋亡率均较低，差异无统计学意义(P&>0.05)。SlugsiRNA组细胞的凋亡率明显增高，与其他两组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.5 细胞凋亡检测

　　FCM显示转染72 h后，AsPC1/pSltugsiRNA和AsPC1/pNegsiRNA细胞的凋亡率为2.1+0.24和2.4+0.25，差异无统计学意义(P&>0.05)。SlugsiRNA组细胞的凋亡率明显增高，为31.7+1.34，明显高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　胰腺癌具有隐匿性和高度侵袭性特点，早期即可发生转移，而胰腺癌早期症状不典型，确诊时大多己处于晚期，大多数患者是外科手术不能治愈的。3年生存率不足10%，5年生存率低于5%，迄今为止，胰腺癌仍然是临床治疗最为困难的消化道恶性肿瘤之一[4]。胰腺癌对目前使用的化疗和放疗等治疗方法具有高度的抵抗性，新的药物如Gemcitabine，虽然已经成为中、晚期胰腺癌治疗的首选用药，但最终会产生耐药性，上述方法除了能达到减压和减轻疼痛的目的之外，却不能控制胰腺癌肿瘤的生长和浸润转移，也不能显著延长患者的中位生存时间，因此需要探索新的胰腺癌治疗方法[5]。

　　目前认为，肿瘤的发生是由于多基因改变导致细胞增殖分化、凋亡失调的结果，肿瘤的基因治疗正日益受到重视，并被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的崭新模式。肿瘤的基因治疗是针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，因此，寻找理想的靶基因是肿瘤基因治疗的前提。

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术由于可以高效、特异地抑制目的基因的表达，在肿瘤靶向治疗中展示出了其不可比拟的优势，具有巨大的潜在应用价值。基于上述理论，我们利用干扰技术成功构建了携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA的真核表达质粒，该表达质粒瞬时转染人胰腺癌细胞株AsPC1后，产生的小片段干扰RNA抑制Slug表达，说明该序列为有效序列。

　　本研究利用RNA干扰技术探讨了Slug沉默后对胰腺癌AsPC1细胞凋亡和增殖的影响。结果发现，SlugsiRNA沉默S1ug后，细胞内S1ug表达被抑制，同时伴随着细胞增殖能力下降，细胞凋亡率的明显提高，说明Slug沉默有效地抑制体外胰腺癌细胞生长。阴性对照组细胞与空白对照组比，Slug表达及对增殖和凋亡方面的影响均无明显差异，说明该质粒可以安全有效地应用。本研究初步证明了利用RNA干扰技术针对Slug靶点能抑制胰腺癌细胞的体外生长，为胰腺癌的基因治疗提供了一个新的切入点。

参考文献

　1 Bol'os V， Peinado H， PerezMoreno M， et al.The transcription factorSlug represses Ecadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions：acomparison with Snail and E47[J]. J Cell Sci，2003，116:499511.

　　2Yang AD，Camp ER，Fan F，et al.Vascular endothelial growth factor receptorl activation mediates epithelial to mesenchymal transition in human pancreatic carcinoma cells[J].Cancer Res， 2006，66(1)：4651.

　　3 Wu WS， Heinrichs S， Xu D.Slug antagonizes p53mediated apoptosis of hematopoieticprogenitots by repressing puma[J].Cell，2005，123(4)：641653.

　　4 Lhr JM. Medical treatment of pancreatic cancer[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2007，7(4)：533544.

　　5 Haag C， Thiede C， Hanig V， et al. Disseminated Intravascular Coagulation(DIC)AfterIntraarterial Injection of Adenoviral Vector Containing P53 in Patients with Pancreatic Cancer in Study[J].Proc Am Soc Clin Oncol，2000，19:345348.

　　1.2.7 RTPCR 按TRizol试剂盒(1nvitrogen公司)说明书操作提取不同组细胞总RNA，取1 μg RNA模按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。引物序列Slug(414 bp)：R:5'CGTCACGACGGGTCAGAT3'，F:5'ATCTGACCCGTCGTGACG3'，反应条件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸7 min，28循环。以上引物由赛百盛公司合成。取5 μL反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用SYNGENE型凝胶成像系统照像，以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量，实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　采用SAS 9.0统计软件进行统计学处理，数据以(±s)表示。组间均数的比较采用SNKq检验或配对t检验，检验水准a=0.05。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒载体PCR鉴定

　　结果显示，仅加ddh30的阴性对照未见条带，加入空载体的阴性对照可见条带，大小约为300 bp左右，加入插入片段载体的阳性对照和加入插入片段的载体的鉴定组可见条带，大小约为364 bp左右，略大于阴性对照的条带。载体的双链DNA片段已正确插入到质粒载体中(图1)。测序结果证明，质粒的目的DNA片段已正确克隆入载体。

　　2.2 SlugsiRNA抑制Slug基因和蛋白表达

　　Slug检测发现，AsPC1/pSlugsiRNA细胞内S1ug蛋白和SlugmRNA表达已被显著抑制，而AsPCl pNegsiRNA细胞内Slug蛋白和SlugmRNA表达无明显变化，提示SlugsiRNA 抑制了细胞内Slug的表达(图2，3)。

　　2.3 MTT检测

　　AsPCl/pSlugsiRNA和AsPCI/pNegsiRNA两组细胞生长能力差异无统计学意义(P&>0.05)。而实验组细胞的生长能力较低，细胞增殖明显滞后于前两组细胞，差异有统计学意义P&<0.05)(图4)。

　　2.4 Annexin VFITC/PI检测

　　FCM显示转染72 h后，AsPC1/pSltugsiRNA和AsPC1/pNegsiRNA细胞的凋亡率均较低，差异无统计学意义(P&>0.05)。SlugsiRNA组细胞的凋亡率明显增高，与其他两组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.5 细胞凋亡检测

　　FCM显示转染72 h后，AsPC1/pSltugsiRNA和AsPC1/pNegsiRNA细胞的凋亡率为2.1+0.24和2.4+0.25，差异无统计学意义(P&>0.05)。SlugsiRNA组细胞的凋亡率明显增高，为31.7+1.34，明显高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　胰腺癌具有隐匿性和高度侵袭性特点，早期即可发生转移，而胰腺癌早期症状不典型，确诊时大多己处于晚期，大多数患者是外科手术不能治愈的。3年生存率不足10%，5年生存率低于5%，迄今为止，胰腺癌仍然是临床治疗最为困难的消化道恶性肿瘤之一[4]。胰腺癌对目前使用的化疗和放疗等治疗方法具有高度的抵抗性，新的药物如Gemcitabine，虽然已经成为中、晚期胰腺癌治疗的首选用药，但最终会产生耐药性，上述方法除了能达到减压和减轻疼痛的目的之外，却不能控制胰腺癌肿瘤的生长和浸润转移，也不能显著延长患者的中位生存时间，因此需要探索新的胰腺癌治疗方法[5]。

　　目前认为，肿瘤的发生是由于多基因改变导致细胞增殖分化、凋亡失调的结果，肿瘤的基因治疗正日益受到重视，并被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的崭新模式。肿瘤的基因治疗是针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，因此，寻找理想的靶基因是肿瘤基因治疗的前提。

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术由于可以高效、特异地抑制目的基因的表达，在肿瘤靶向治疗中展示出了其不可比拟的优势，具有巨大的潜在应用价值。基于上述理论，我们利用干扰技术成功构建了携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA的真核表达质粒，该表达质粒瞬时转染人胰腺癌细胞株AsPC1后，产生的小片段干扰RNA抑制Slug表达，说明该序列为有效序列。

　　本研究利用RNA干扰技术探讨了Slug沉默后对胰腺癌AsPC1细胞凋亡和增殖的影响。结果发现，SlugsiRNA沉默S1ug后，细胞内S1ug表达被抑制，同时伴随着细胞增殖能力下降，细胞凋亡率的明显提高，说明Slug沉默有效地抑制体外胰腺癌细胞生长。阴性对照组细胞与空白对照组比，Slug表达及对增殖和凋亡方面的影响均无明显差异，说明该质粒可以安全有效地应用。本研究初步证明了利用RNA干扰技术针对Slug靶点能抑制胰腺癌细胞的体外生长，为胰腺癌的基因治疗提供了一个新的切入点。

参考文献

　1 Bol'os V， Peinado H， PerezMoreno M， et al.The transcription factorSlug represses Ecadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions：acomparison with Snail and E47[J]. J Cell Sci，2003，116:499511.

　　2Yang AD，Camp ER，Fan F，et al.Vascular endothelial growth factor receptorl activation mediates epithelial to mesenchymal transition in human pancreatic carcinoma cells[J].Cancer Res， 2006，66(1)：4651.

　　3 Wu WS， Heinrichs S， Xu D.Slug antagonizes p53mediated apoptosis of hematopoieticprogenitots by repressing puma[J].Cell，2005，123(4)：641653.

　　4 Lhr JM. Medical treatment of pancreatic cancer[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2007，7(4)：533544.

　　5 Haag C， Thiede C， Hanig V， et al. Disseminated Intravascular Coagulation(DIC)AfterIntraarterial Injection of Adenoviral Vector Containing P53 in Patients with Pancreatic Cancer in Study[J].Proc Am Soc Clin Oncol，2000，19:345348.