小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究

【摘要】 目的：探讨微囊对原始生殖细胞(PGCs)定向分化为神经样细胞的诱导效果。方法：用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体(EBs);将孕13 d胎鼠的大脑半球取出，将其中的神经干细胞(NSCs)作为包在微囊里的成分。待EBs贴壁后将含有NSCs的微囊放入其中，同时另外孔板中放入等量的EBs让其自然分化。将微囊诱导分化出的细胞进行NESTIN、NSE和GFAP免疫染色鉴定。结果：用微囊诱导定向分化为神经样细胞的比例显著高于自然分化的比例。结论：悬浮培养可使PGCs形成EBs，将EBs贴壁培养可自发分化形成内、中和外三个胚层的细胞，即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞。通过微囊的诱导方法可以使EGs定向分化为神经样细胞。

【关键词】 原始生殖细胞;细胞分化;Western 免疫印迹;神经干细胞;小鼠

　　[ABSTRACT] Objective: To explore the inducing effect of microencapsulation on differentiation of PGCs(primordial germ cells) into neuronal cells. Methods: Took cerebra from the 13days old mouse embryos，encapsulated neuronal stem cells(NSCs) collected from the cerebra into microencapsulation. EBs(embryoid bodies) were formed from the PGCs collected from13 days mouse embryos by suspension culture. The microencapsulation were put in the culture plates after the EBs were plated on gelatincoated culture plates. Furthermore， the same amount of EBs were plated on gelatincoated culture plates without microencapsulation for spontaneous differentiation. The neuronal cells were detected with NESTIN， NSE and GFAP immunohistochemical staining. Results: The rate of differentiation by microencapsulation was distinctly higher than the rate of spontaneous differentiation. Conclusion: The nutritional components secreted from the microencapsulation enter the culture medium and can induce the differentiation of EBs into neuronal cells effectively.

　　[KEY WORDS] Primordial germ cell; Cell differentiation; Western blot; Neuronal stem cells; Mouse

　　原始生殖细胞(primordial germ cells， PGCs)是一种胚胎源性干细胞，具有体外分化为各种组织的能力[1]，我们已探讨了其体外自发分化的能力，发现其分化为神经样细胞的百分比最大。为了进一步提高神经样细胞的分化率，本文将重点探讨PGCs向神经样细胞定向分化的新方法，即微囊诱导法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　ICR小鼠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PGCs的分离、提取和体外培养 实验使用自配13 d胎鼠，取两侧生殖嵴，用PBS洗3次后添加0.25%胰蛋白酶消化，吹打，然后过60目细胞筛，将PGCs按2.5×106/mL的密度接种于35 mm的培养瓶中进行体外培养。

　　1.2.2 悬浮培养 (1)类胚体(embryoid bodies， EBs)的形成：取分离提取的PGCs，置于培养瓶中进行悬浮培养，培养期间每隔1～2 h摇晃1次培养瓶防止PGCs贴壁。换液方法：将含细胞的培养液放入离心管里1 000 r/min离心10 min，弃上层液体，补足培养液。(2)EBs的鉴定: 使用免疫组织化学法，对EBs进行甲胎蛋白(alpha fetoprotein， AFP)标记，将悬浮培养4 d的EBs经4%多聚甲醛固定15 min，然后用甲醇在-20℃固定5 min，5%BSA覆盖EBs，处理45 min以封闭非特异性染色。然后滴加一抗(兔抗人AFP多克隆抗体工作液购自中杉公司，ZA0008)，在4 ℃孵育过夜，继之滴加生物素化山羊抗兔IgG，最后滴加DAB显色。

　　1.2.3 微囊制作 (1)神经干细胞的提取及鉴定：①将孕13 d 胎鼠的大脑半球取出，在解剖镜下剥去软脑膜，然后将其置于预冷的含有谷氨酰胺的高糖DMEM培养液中，最后用PBS冲洗3遍，再加入0.25%胰蛋白酶于37 ℃水浴消化10 min，每3 min摇匀1次。消化完毕后将消化液吸出，然后加入培养液终止消化，吹打成单细胞悬液后放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养。所用培养液为高糖DMEM，内添加10% FBS(Hyclone)和200 mM L谷氨酰胺(Lglutamine， LGlu)(Hyclone)和1∶1的青链霉素。②将形成的神经球放入预先用0.05%PL多聚赖氨酸(Sigma)包被的含有盖玻片的小皿中培养24 h后，使用免疫组化的方法对神经干细胞巢进行Nestin标记。(2)微囊制作：首先将含原代NSCs的培养液1 000 r/min，离心5 min， 加入上述培养液调整NSCs的浓度为1.8×106/mL，将该细胞悬液与1.5%海藻酸钠(Sigma)1∶1混合，避免气泡的产生。然后用装有4号针头的1 mL注射器将液滴均匀并快速的滴入含1.1%CaCl2的小皿中，形成凝胶珠，吸掉CaCl2后加入0.05%PL多聚赖氨酸(Sigma)作用6 min， 然后再用1% CaCl2(北京红星化工厂)清洗2遍，再与0.15%海藻酸钠作用5 min，用1% CaCl2和0.9%NaCl分别清洗，最后再与0.05 mol/L柠檬酸钠(北京化工厂)作用6 min，用0.9%NaCl清洗，然后放入培养液培养。

　　1.2.4 EBs的体外分化 (1)微囊的定向诱导分化：悬浮培养第4天后，收集含有EBs的培养液，800 r/min离心5 min，弃上层液体，下层留有0.2～0.3 mL液体轻轻吹打，然后将液体放入0.1%明胶包被的24孔板中，实验分两组，一组是待EBs贴壁后将微囊放入孔板中，每孔放入10个微囊，另一组则不加微囊让其自发分化，每组分别重复做6次。(2)分化细胞的鉴定：使用免疫组织化学法，对分化的神经样细胞进行NESTIN、NSE和GFAP标记。将分化的细胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用甲醇在-20 ℃固定5 min，再用5%BSA覆盖细胞处理45 min以封闭非特异性染色。然后分别滴加一抗(兔抗Nestin多克隆抗体;鼠抗人NSE单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZM0203;兔抗人GFAP多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZA0117)，然后在4 ℃孵育过夜，继之滴加生物素化山羊抗兔IgG，最后滴加DAB显色。

　　2 结果

　　2.1 EBs的形成与鉴定

　　PGCs经4 d悬浮培养后，便可逐渐形成简单类胚体(simple embryoid body， SEB)，自第5天起SEB内部出现腔隙，随后逐渐扩大直到第2周形成囊状EBs(cystic embryoid body， CEB)。EBs的形成率见表1。EBs外周可见内胚层细胞，经免疫组织化学法进行AFP标记，可见EBs外围的细胞呈阳性反应。

　　2.2 神经干细胞微囊的形态学观察及鉴定

　　2.2.1 神经干细胞微囊的形态学观察 细胞微囊大小较均一，呈球行，边界清楚，直径400～700 μm，微囊分散良好且之间无粘连，囊内细胞密集，单个细胞呈圆形且折光性强，每个微囊含有9 000～10 000个神经干细胞。表1 EBs形成率与分化率

　　 2.2.2 神经干细胞的鉴定 当培养24 h后可见NSCs聚集形成神经球，折光性强，立体感强并且悬浮生长，神经球形成后有相互聚集的倾向，自身不断增殖且数目不断增多。将贴于盖玻片上的神经球进行神经干细胞标记巢蛋白(nestin)染色，结果显示Nestin免疫染色呈阳性，阳性部位呈黄褐色，证明神经球确为神经干细胞。

　　2.3 分化细胞的鉴定以及分化率

　　分别做NESTIN、NSE和GFAP的免疫组化染色，结果都为阳性，说明分化细胞中包括神经前体样细胞、神经元和神经胶质细胞。自发分化有60%分化为神经样细胞，上皮样细胞和成纤维样细胞各占总数的20%和18%，而微囊诱导则有100%分化为神经样细胞。实验组与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　在PGCs的定向诱导分化方面，一般采用添加诱导因子法[2]，我们则尝试着采用一种新方法即微囊诱导法。目前所用制作微囊的材料和结构多为海藻酸钠多聚赖氨酸海藻酸钠(AlginatePolylysine Alginate， APA)，这种结构的膜具有较好的生物相容性，可减少邻近细胞的过度生长[3]。微囊的优点在于，微囊是一种半透膜，细胞分泌的小分子营养物质可自由透过，而且这种半透膜也不影响氧、葡萄糖和生长因子等低分子物质的通过。另一方面可以将诱导物与贴壁的EBs分开，避免了两者的相互作用从而更清晰的看到分泌物是否对生殖干细胞的分化有一定的诱导作用。经微囊诱导分化出来的细胞免疫组化鉴定100%为神经样细胞;而自发分化的细胞60%为神经样细胞。说明微囊诱导可明显提高细胞的分化率。NSCs是一种未分化的神经前体细胞，能分泌多种细胞因子，其在体外模拟的神经细胞发育的早期微环境较神经元模拟的微环境更为原始和类似于体内[4]。总之，胚胎源性干细胞的分化研究在整个干细胞研究中占据着重要的位置，因为它将会在临床应用中发挥着非常重要的作用。它最令人瞩目之处在于它可以作为移植疗法的"种子"细胞，治疗各种难治性疾病，包括帕金森病、糖尿病、脊髓外伤、慢性心脏疾病、肝脏衰竭和肿瘤等。这种方法不仅可以弥补当今器官移植所面临的供体匮乏问题，而且还可避免移植过程中引起的免疫排斥问题，因为可借助于基因工程技术对干细胞表面的MHC分子进行修饰。可见胚胎源性干细胞在基础研究和临床应用方面有着广阔的前景。但目前为止人们还没掌握其定向分化的一般规律，需要我们进一步的探讨。

参考文献

　　1 Rohwedel J， Sehlmeyer U， Shan J， et al.Primordial germ cellderived mouse embryonic germ (EG) cells in vitro resemble undifferentiated stem cells with respect to differentiation capacity and cell cycle distribution[J].Cell Biol Int，1996，20(8):579587.

　　2 Guan K， Chang H， Rolletschek A， et al. Embryonic stem cell derived neurogenesis. Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells[J]. Cell Tissue Res， 2001，305(2):171176.

　　3 Lim F， Sun AM. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas[J]. Science，1980，210(4472): 908910.

　　4 田毅浩，戴翼斌，徐进，等.混合培养对骨髓基质转化为神经元的影响[J].解剖学报，2005，36(2):140144.