乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶9在胃癌中的表达及临床意义

【摘要】 目的：探讨乙酰肝素酶(Hpa)、基质金属蛋白酶9(MMP9)在胃癌组织中表达的临床病理意义及其与胃癌进展的关系。方法：采用免疫组化SABC法检测65例胃癌、20例癌旁非瘤组织中Hpa、MMP9的表达，比较胃癌和癌旁非瘤组织以及不同肿瘤浸润深度及淋巴结有无转移胃癌患者Hpa、MMP9的阳性表达，并对Hpa、MMP9在胃癌中的表达进行相关性分析。结果：胃癌组织Hpa、MMP9阳性表达率(60.0%、55.4%)均明显高于癌旁非瘤组织(15.0%、15.0%)(P均&<0.01);Hpa 及MMP9表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移关系密切(P&<0.05);胃癌组织中Hpa和MMP9的表达呈正相关(rs=0.531，P=0.000)。结论：Hpa、MMP9在肿瘤侵袭转移中起重要作用，可作为胃癌预后判断的指标。

【关键词】 胃肿瘤;乙酰肝素酶;基质金属蛋白酶9;免疫组织化学

　　　　 [ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P&<0.01)， and their expressions correlated to the invasion depth and lymphatic metastasis(P&<0.05)， and also Hpa expression was positively correlated to MMP9 expression in gastric carcinoma tissue(rs=0.531，P=0.000). Conclusion： Hpa and MMP9 may play an important role in the invasion and metastasis of gastric carcinoma and can be a prognostic indicator.

　　[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry

　　肿瘤细胞的侵袭和转移是一个复杂的多步骤过程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已确定的唯一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通过特异性降解HSPG发挥其促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用;基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一种锌离子依赖性内肽酶，主要降解细胞外基质和基底膜中的胶原蛋白，在破坏细胞外基质和基底膜的屏障作用、促进肿瘤细胞侵袭和转移的过程中同样具有作用。Hpa mRNA的检测在多种肿瘤中已有研究报道，但目前联合检测Hpa和MMP9在胃癌中的表达少有报道，本实验对65例胃癌切除标本Hpa和MMP9的表达进行了检测，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选取河源市人民医院2003～2005年胃癌手术切除标本65例，男性47例，女性18例，年龄35～78岁，中位年龄60岁，其中有淋巴结转移者40例。所有病例术后均经病理证实。另取癌旁非瘤组织20例作为对照，癌旁组织距离肿瘤边缘不小于5 cm。

　　1.2 Hpa、MMP9的检测

　　采用免疫组化SABC法进行检测。Hpa抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品，均在4℃冰箱保存。用已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 结果判定标准

　　1.3.1 Hpa Hpa以细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。参照Friedmann等[1]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞记数仅限于肿瘤细胞染色。染色强度分级如下：无着色为0，淡黄色为1，黄色及更深颜色为2;阳性细胞数分级为:阳性细胞数小于50%为0， 50%～75%为1，&>75%为2。染色强度分级与阳性细胞数分级两项得分相乘结果≥2为阳性表达。

　　1.3.2 MMP9 MMP9以细胞浆和/或细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，参照Liaball等[2]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞计数仅限于肿瘤细胞染色，10%及以上细胞阳性染色的切片为阳性，10%以下阳性染色的切片为阴性。

　　1.4 统计学处理

　应用SPSS10.0统计软件，行χ2检验或精确概率法及Spearman相关性检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 Hpa的表达

　　Hpa蛋白阳性表达主要位于细胞浆和/或细胞膜，肿瘤间质中的血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞也偶有阳性表达，胃癌中Hpa的阳性表达率为60%(39/65);在癌旁非瘤组织中，血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞偶有阳性表达， Hpa的阳性表达率为15%(3/20)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=12.390，P&<0.01)。

　　2.2 MMP9的表达

　　MMP9在正常胃黏膜细胞中着色均匀，主要分布于细胞胞浆内，阳性表达率为15%(3/20);在胃癌组织中的表达异质明显，呈灶状或弥散性分布，阳性表达率为55.4%(36/65)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=10.046，P&<0.01)。

　　2.3 不同肿瘤浸润深度及淋巴结有无转移胃癌患者Hpa、MMP9的表达

　　肿瘤浸润深度达到或超过浆膜层的胃癌患者Hpa、MMP9的阳性表达率明显高于未达浆膜层者，差异有统计学意义(P&<0.05)，有淋巴结转移的胃癌患者Hpa、MMP9的阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P&<0.05)，见表1。表1 不同肿瘤浸润深度及淋巴结有无转移胃癌患者Hpa、MMP9的表达

　　2.4 Hpa、MMP9在胃癌中阳性表达的相关性

　　经相关性检验，Hpa、MMP9在胃癌组织中的表达呈正相关(rs=0.531，P=0.000)，见表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表达的相关性

　　3 讨论

　　肿瘤细胞对细胞外基质(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是肿瘤浸润、转移的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人体内降解ECM的主要酶类，参与肿瘤演进等众多生理和病理过程[3，4]，MMP9作为MMPs家庭重要成员，具有广泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型胶原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究结果显示胃癌组织MMP9表达显著高于临近的正常胃粘膜，MMP9高表达的胃癌患者生存期明显缩短;David等[7]研究表明，与正常胃粘膜相比，胃癌组织MMPs表达明显升高，MMPs表达与胃癌分期密切相关。本实验结果显示，淋巴结转移患者MMP9阳性表达率明显高于无淋巴结转移者，说明MMP9在胃癌细胞突破基底膜向周围淋巴结转移过程中起着重要的作用; MMP9的表达还与胃癌的浸润深度密切相关(P&<0.05)，这与张成武等[8]的研究结果基本一致。

　　Hpa是目前发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在肿瘤细胞的侵袭和转移中具有重要的意义。 Vlodavsky等[9]研究发现高转移潜力的肿瘤细胞Hpa活性比低或无转移潜力的肿瘤细胞高4～10倍。在卵巢腺癌、转移性黑色素瘤细胞、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈优势表达。Hulett等[10]也发现高转移的鼠腺癌细胞系表达高水平Hpa mRNA，而低转移细胞系仅有少量表达。Takaoka等[11]用RTPCR检测胃癌组织中Hpa的表达发现，正常胃粘膜组织中无Hpa的表达，胃癌组织中Hpa的表达与肿瘤体积和局部淋巴结转移有明显正相关性，高表达Hpa的患者预后差。本研究结果显示，Hpa的阳性表达与胃癌的浸润深度及有无淋巴结转移密切相关，表明在胃癌的进展过程中，Hpa具有重要的作用。本研究还发现，Hpa和MMP9在胃癌细胞上的表达呈正相关，推测Hpa和MMP9在胃癌浸润转移过程中存在相互关联、相互作用，联合检测Hpa和MMP9在判断肿瘤生物学行为及预后方面具有重要意义。

参考文献

1 Friedmann Y， Vlodavsky I，Aingon H，et al. Expression of heparanase in normal， dysplastic， and neoplastic human colonic mucosa and stroma evidence for its role in colonic tumorigensis[J]. Am J Pathol， 2000，157(4):11671175.

　　2 Liaball NB， Talbot I， Smith RA， et al. Matrix metalloprtease 2 (MMP2) and matrix metalloprtease 9 (MMP9)， type IV collagenase in colorectal cancer[J]. Cancer Res， 1996，56(3):190196.

　　3 Chambers AF， Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloprotinases inmetastasis [J].J Natl Cancer Inst， 1997，89(17):12601270.

　　4 陈莉萍，刘嘉茵.血清基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制剂-1在接受IVF-ET患者中的测定[J].实用临床医药杂志，2008，12(9)：110111.

　　5 Liotta LA， Steeg PA， StetlerStevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation[J].Cell，1991，64(2):327336

　　6 Sier CFM， Kubben FJ， Canesh S， et al. Tissue levels of matrix metalloproteinase MMP2 and MMP9 and related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer， 1996，74:413 417.

　　7 David L， Nesland J， Holm R， et al. Expression of lamin， collafen Ⅳ， fibronectin and type Ⅳcollafenase in fastric carcinoma[J]. Cancer，1994，13:518527.

　　8 张成武，邹寿椿，徐文娟，等.胃癌基质金属蛋白酶临床意义 [J].中国胃肠外科杂志，2000，3(1):2527.

　　9 Vlodavsky I， Fridmann Y， Elkin M， et al. Mammalian heparanase: gene cloning， expression and function in tumor progression and metastasis[J]. Nat Med， 1999，5(7):793802.

　　10 Hulett MD， Freeman C， Hamdorf BJ， et al. Cloning of mammalian heparanase， an important enzyme in tumor invasion and metastasis[J]. Nat Med， 1999，5(7):803809.

　　11 Takaoka M， Naomoto Y，Ohkawa T， et al.Heparanase expression correlates with invasion and poor prognosis in gastric cancers[J]. Lab Invest， 2003，83(5):613622.