膀胱出口梗阻后逼尿肌中转化生长因子β1的表达与膀胱重量改变的关系

　　　　 作者：白志明，刘振湘，吕蔡，张冲，吴万文

【摘要】 目的：探讨膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌中转化生长因子β1 (TGF)β1的表达与膀胱重量改变的关系。方法：随机选择2003年6月至2005年6月入院患者21例，其中BOO患者16例(BOO组)，为住院诊断良性前列腺增生症(BPH)患者，行耻骨上经膀胱前列腺摘除术;对照组5例，为外伤等情况入院并排除有下尿路梗阻病史者，行开放手术治疗。两组术前均行B超检查测定膀胱重量，术中切取膀胱上壁组织，检测膀胱逼尿肌中TGFβ1mRNA的表达，并比较其与膀胱重量的相关性。结果：BOO组与对照组膀胱重量分别为(92.15±34.89)、(56.08±20.35)g，BOO组明显高于对照组(P&<0.05);与对照组[(0.18±0.13)×106]相比，BOO组TGFβ1mRNA表达量[(3.60±7.30)×106]显著增加(P&<0.01);且BOO组中TGFβ1mRNA表达量与膀胱重量改变呈明显正相关(P&<0.05)，而对照组无相关性。结论：BOO后膀胱逼尿肌中TGFβ1表达明显增加，其可能在膀胱逼尿肌的功能改变中发挥作用。

【关键词】 海口市人民医院泌尿外科，海南 海口 570208)

　　 [ABSTRACT] Objective: To determine correlation between expression of detrusor TGFβ1 and change of bladder mass in patients with bladder outlet obstruction (BOO). Methods: Sixteen patients with BOO due to benign prostatic hyperplasia underwent via suprapubic prostatectomy (group A) and five patients with bladder trauma underwent open surgical procedures and ruled out lower urinary tract obstruction (group B) were selected randomly from June 2003 to June 2005 and studied. The bladder mss of patients was determined by ultrasonography before operation， and a small patch of bladder was resected in the operation， which was detected for expression of TGFβ1 mRNA， and correlation of bladder mass with TGFβ1 was studied using Pearson correlation. Results: The bladder mass of patients in group A and B was (92.15±34.89) g and (56.08±20.35) g respectively， the difference between them was significant (P&<0.05);expression of TGFβ1 mRNA in bladders of patients in group A and B was(0.18±0.13)×106 and(3.6±7.3)×106 respectively， the difference between them was significant (P&<0.01)， and the change of bladder mass was positive correlated with the expression of TGFβ1 mRNA in patients of group A (P&<0.05)， and there was no correlation of bladder mass and expression of TGFβ1 mRNA in patients of group B. Conclusion: Expression of bladder detrusor TGFβ1 mRNA increases substantially in patients with BOO， which may play an important role in the change of bladder detrusor function.

　　[KEY WORDS] Transforming growth factorβ1 (TGFβ1); Bladder; Drtrusor; Outlet obstruction

　　良性前列腺增生症(BPH)是引起膀胱出口梗阻(BOO)最常见的原因之一，BPH患者临床症状、表现与BOO后膀胱逼尿肌结构及功能改变密切相关[1]，而逼尿肌的功能状态是判断是否行外科手术干预及其疗效的主要指标。我科随机筛选临床BPH病例，研究BOO后膀胱逼尿肌中转化生长因子β1(TGFβ1)表达的改变及其与膀胱重量的关系，探讨TGFβ1在BOO后逼尿肌结构、功能改变中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　选取我科2003年6月～2005年6月收治的16例BPH患者(BOO组)，均为男性，年龄54～83岁，平均73.8岁。对照组5例，平均年龄67.2岁，其中外伤致膀胱破裂1例，尿道断裂2例，输尿管壁间段结石2例，均排除有下尿路梗阻病史可能。以上病例均行开放手术治疗，参照B超预测膀胱重量方法[2，3]：假设膀胱是一个球体，通过B超测量膀胱壁的厚度以及膀胱容量来测算出膀胱重量。术前行B超检查估算膀胱重量，术中提取膀胱逼尿肌组织标本2 cm×1 cm×1 cm大小备用。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　TRIZol(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(德国QIAGEN 公司)，5×定量PCR buffer(美国ABI公司)，dNTPs(25 mmol/L)0.2μL(上海生工)，上游引物F(25 μmol/L)(达安基因)，下游引物R(25 μmol/L)(达安基因)， dNTPs(10 mmol/L)(Sigma公司)，荧光探针(20 μmol/L)(达安基因)，Taq 酶(美国ABI公司)。紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini1240)，PE9600PCR仪(美国Perkin Elmer公司)，荧光定量仪PE 7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。

　　1.3 组织RNA的提取及样品鉴定

　　组织块(约100 mg)置匀浆器，加TRIZol(100 mg组织加TRIZol 2 mL)，冷冻匀浆，置Eppendorf 管，15～30℃孵育5 min，加入氯仿(0.2mL氯仿/1mL TRIZol)，盖紧盖子，用力摇动15s，15～30℃孵育2～3 min，4℃12 000 r/min 离心15 min，取上清液至新的Eppendorf 管，加异丙醇(0.5mL异丙醇/mL TRIzol)，15～30℃孵育样品10 min，4℃12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，75% 乙醇洗涤沉淀1次(至少1 mL 75%乙醇/1mL TRIzol)，4℃7 500 r/min 离心5 min，弃乙醇，空气或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入2.5倍体积乙醇，置-80℃保存。

　　浓度计算：每份样品在紫外分光光度计上测定波长为260 nm时的吸光度值。浓度计算公式：浓度(g/L)=OD260×稀释倍数×40/1 000。

　　1.4 逆转录反应

　　取5μL RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9600PCR仪，反应体系如下：德国QIAGEN 公司RTPCR试剂盒，5×逆转录buffer 4 μL;上游引物0.4 μL;下游引物0.4 μL;dNTPs(25mmol/L)0.2 μL;MMLV (10 U/μL)1 μL;DEPC水9 μL;RNA模板5 μL;总体积： 20 μL;逆转录buffer成分：50 mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT;反应条件：37℃ 1 h，然后95℃3 min。

　　1.5 荧光定量PCR反应

　　用荧光定量仪PE 7000全自动荧光定量PCR仪检测肌球蛋白、肌动蛋白mRNA表达。肌球蛋白的上、下游引物分别为： 5′TCGACGTCACGGGTTACATC3′， 5′CGAATTGCCC GTGATTTTTC3′，探针为：5′FAMTGGGAGCCAACATTGAGACCTATCTGCTTAMRA3′;肌动蛋白分别为：5′GCGCGGCTACAGCTTCA3′，5′TCTCCTTAATGTCACGCACGAT3′， 5′FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA3′。样本按以下反应体系进行：5×定量PCR buffer10 μL;上游引物F(25 μmol/L)1μL，下游引物R(25 μmol/L)1 μL， dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，荧光探针(20 μmol/L)1 μL，Taq 酶1.5 μL， cDNA 5 μL，ddh3O 30 μL，总体积：50 μL，PCR buffer成分：10 mmol/L TrisHCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，反应条件为：93℃ 2 min，然后93℃45 s，55℃1 min，共40循环。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。结果按B=拷贝数/μL cDNA进行分析。考虑到各个样本总RNA浓度的差异，最终计算结果按下列公式换算：A (拷贝数/μg总RNA)= B(拷贝数/μL cDNA)÷OD260×5/6。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS V11.5统计软件进行统计分析，实验指标的mRNA表达以拷贝数/μg总RNA表示，组间比较采用非参数MannWhitney U检验，组内参数间相关性比较采用Pearson直线相关分析，检验水准a=0.05。

　　 2 结果

　　BOO组膀胱重量[(92.15±34.89)g]明显高于对照组 [(56.08±20.35)g](P&<0.05)，逼尿肌中TGFβ1mRNA的表达量[(3.60±7.30)×106]亦明显高于对照组[(0.18±0.13) ×106] (P&<0.05)。BOO组中TGFβ1mRNA表达量与膀胱重量改变明显正相关(r=0.516，P&<0.05)，而对照组无相关性(r=-0.196，P&>0.05)。

　　3 讨论

　　BPH是引起老年男性BOO的常见疾病，常产生一系列严重的并发症，如尿潴留、上尿路扩张及肾功能损害等。BOO后膀胱排尿功能障碍的主要原因是膀胱逼尿肌的结构及收缩功能发生异常改变，逼尿肌早期对梗阻的反应是平滑肌的肥大，这只是膀胱内压增加的一种适应性反应，但必然伴有平滑肌细胞内外功能的改变[2，3]。白志明等[4]研究提示BOO后膀胱逼尿肌中的肌动蛋白、肌球蛋白表达量显著增加，肌动/球蛋白比例亦上调，且与膀胱重量变化之间均有显著正相关性，表明膀胱重量的增加可由于膀胱壁超微结构及其成分的改变引起。Brierly等[5]探讨了BPH患者出现BOO症状后膀胱逼尿肌超微结构的改变，12例经尿动力学证实存在BOO的BPH患者(平均年龄66岁)，通过电子显微镜观察逼尿肌活检组织的结构变化，结果12例中有8例表现出逼尿肌肌肥大改变，其中4例同时伴有逼尿肌收缩力的下降。

　　TGFβ1属于TGFβ超家族成员，是一类具有激素样活性的多肽，通过与其特异性受体结合发挥生物学作用。TGFβ1具有广泛的生物学效应，在体内TGFβ1可能是以旁分泌形式作用于上皮细胞，参与机体内多种细胞的发育、增殖、分化等的调节。TGFβ1是成纤维细胞和其他间叶细胞强有力的有丝分裂原，能刺激间质细胞生长，还能使碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的产生增加。TGFβ1还具有调节细胞外基质成分如纤维连接蛋白、胶原的合成与降解的功能，导致细胞外基质的堆聚，从而增加细胞对生长因子的反应[6]。TGFβ1是影响器官纤维化最主要的细胞因子，在多种器官的纤维化中的作用一直是近年来的研究热点。Tuxhorn等[7]研究发现TGFβ1诱导人前列腺癌细胞外基质组织中Vimentin、平滑肌α肌动蛋白和胶原Ⅰ的表达增加，间质呈肌成纤维细胞样表现。有关TGFβ1在下尿路梗阻性疾病中的作用报道较少。

　　本研究通过随机筛选临床BPH病例，探讨BOO后膀胱逼尿肌中TGFβ1表达的改变及其与膀胱重量的关系，结果显示BOO组膀胱重量明显高于对照组，逼尿肌中TGFβ1mRNA的表达量亦明显高于对照组，BOO组中TGFβ1mRNA表达量与膀胱重量改变明显正相关，而对照组无相关性，表明BOO后逼尿肌中TGFβ1的表达升高与膀胱重量增加密切相关。孙小兵等[8]报道BOO后TGFβ1的分泌增加可促进逼尿肌肌层产生大量胶原纤维，后者沉积于逼尿肌细胞之间，同时细胞间中间连接明显减少，进而影响膀胱逼尿肌细胞有效的协同收缩，提示TGFβ1与梗阻后产生的膀胱肌层纤维化进程密切相关。但由于膀胱逼尿肌的收缩功能同时还受到其他相关因素的影响，如生长因子、神经递质等，具体的作用机制有待深入研究。

参考文献

1 Valentini FA， Levin RM， Besson GR， et al. Study of detrusor dysfunction due to outlet obstruction: link between analysis of uroflows of men with benign prostatic hyperplasia and animal studies[J]. Adv Exp Med Biol，2003，539(PtA):297309.

　　2 Takahashi R， Nishimura J， Hirano K， et al. Ca2+ sensitization in contraction of human bladder smooth muscle[J]. J Urol ，2004，172(2):748752.

　　3 Zhang EY， Stein R， Chang SH， et al. Smooth muscle hypertrophy following partial bladder outlet obstruction is associated with overexpression of nonmuscle caldesmon[J]. Am J Pathol， 2004，164(2):601612.

　　4 白志明，刘振湘，魏小斌，等.膀胱出口梗阻后逼尿肌收缩蛋白表达和膀胱重量的改变[J].中国男科学杂志，2007，21(8)：1417.

　　5 Brierly RD， Hindley RG， Mclarty E， et al. A prospective evaluation of detrusor ultrastructural changes in bladder outlet obstruction[J]. BJU Int，2003，91(4):360364.

　　6 Morrissey J， Guo G， Moridaira K， et al. Transforming growth factorbeta induces renal epithelial jagged1 expression in fibrotic disease[J]. J Am Soc Nephrol，2002，13(6):14991508.

　　7 Tuxhorn JA， Ayala GE， Smith MJ， et al. Reactive stroma in human prostate cancer: induction of myofibroblast phenotype and extracellular matrix remodeling[J]. Clinic Cancer Res，2002， 8(9):29122923.

　　8 孙小兵，卜照耘，张维东，等.TGFβ1对膀胱逼尿肌Ⅲ型胶原表达的调节作用[J].中华小儿外科杂志，2005，26(3)：148150.