mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

　　　　　　作者：黄海雁，文梦灵，张惠玲

【摘要】 目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体(FSHR) 基因N端部分片段(2890aa)(mFSHRn);预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒，并在大肠杆菌中表达。方法： 提取小鼠睾丸组织总RNA，利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术反转录成cDNA，按照GeneBank中小鼠FSHR N端序列设计引物，扩增基因片段并插入pET32a载体，测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E. coli BL21(DE3)感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186 bp， 测序结果与预期结果完全一致，生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论: mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗，成功构建了pET32amFHSRn原核表达重组质粒，获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株，为后续的相关研究奠定了基础。

【关键词】 卵泡刺激素受体 ;原核 ; 表达 ;生物信息学分析

　　 Objective: To clone follicle stimulating hormone receptor gene N terminal fragment (2890aa) (mFSHRn)， and to forecast the possibility of its encoding protein being pregnancy vaccine， and to construct prokaryotic expression recombinant plasmid and express it in colibacillus. Methods： Mouse testis RNA was extracted and inversely transcribed to cDNA by means of RTPCR. The primer was designed according to mouse FSHR N terminal sequence of Genebank， and then gene fragments were amplified and pET32a vector was inserted. After sequencing， bioinformatics was analyzed. Expression protein was induced by plasmid transformation E. coli BL21 (DE3) competence strain. Results： The amplification length was 186bp， sequencing and expectation was completely concord. Bioinformatics analysis showed the encoding protein had satisfactory antigenicity. The restructuring prokaryotic expression plasmid obtained recon and induced expression.Conclusion： mFSHRn protein can be a reliable candidate of pregnancy vaccine. We successfully construct pET32amFHSRn prokaryotic expression recombinant plasmid and gain mFHSRn expressing colibacillus strain， and lay a foundation for further study.

　　[KEY WORDS] Follicle stimulating hormone receptor;Protocaryon; Expression; Bioinformatics analysis

　　卵泡刺激素(folliclestimulating hormone ，FSH)是一种糖蛋白激素，通过特定的G蛋白偶联受体在细胞膜表面发挥作用。卵泡刺激素受体(folliclestimulating hormone receptor， FSHR)是一种寡聚糖蛋白构成的膜受体， 4个单体由二硫键连接，属于G蛋白偶联受体家族。人FSHR由695个氨基酸组成：氨基端17个氨基酸为疏水性信号肽;紧接信号肽的是349个氨基酸组成的亲水性结构区，由亮氨酸-精氨酸-精氨酸序列构成的交替β片层和α螺旋结构组成，构成FSHR的胞外区;接着是264个氨基酸构成的跨膜区，由7个徘徊式穿越细胞膜的疏水段组成;胞内区是65个氨基酸组成的羧基末端。

　　多年来，免疫避孕疫苗用于控制男性生育的研究日益增多，以几种生殖激素、激素受体和精子特异蛋白作为靶抗原为主。近年来的相关研究表明选择特异性结合靶点的多肽片段对疫苗的选择和免疫功能很重要，可以提高疫苗的特异性和免疫效果，是有前景的研究重点之一。FSH通过FSHR N端上富含亮氨酸的特异性胞外跨膜结合区域结合而发挥生理作用。为明确FSHR的免疫避孕作用，不少学者研究了包括FSHR全长以及不同多肽片段的疫苗实验[13]，但疫苗的高效性、可逆性等方面仍存在不同程度的缺陷。Fan等[4]报道了FSHR与FSH复合物的晶体结构模型，表明FSHR上N端半胱氨酸簇以及亮氨酸富集区(LRRs)共同决定了FSHR结合区，并阐述了N端的多段肽片段是FSHR上的特异性结合区。另外由于目前FSHR市售抗体均针对FSHR C端设计，使其在蛋白质水平及其相关的研究受到了限制。为此，本研究对FSHR基因N端序列进行了抗原性等分析，选择其部分片段mFSHRn(2890aa)进行克隆并构建了此基因的原核表达载体，在大肠杆菌中得到表达，为FSHR N端基因的进一步相关研究奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株、质粒和实验动物：大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和原核表达载体pET32a为本实验室保存;BALB/C小鼠，雄性，9周龄，购自南方医科大学实验动物中心。

　　1.1.2 工具酶和试剂：限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、 T4DNA连接酶、DNA Polymerase、RNaseOUTTM 核酸酶抑制剂为TaKaRa公司产品;DNA凝胶纯化试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒为Omega公司产品;TRIzol试剂、MMLV逆转录酶为Invitrogen公司产品;HRP抗His抗体为晶美公司产品;其他试剂均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 序列的生物信息学分析 用Vector NTI 9.0软件预测FSHRn片段编码蛋白的疏水性、柔韧性、抗原性、亲水性和极性肽段，并对其二级结构进行预测分析。采用BLAST在线工具对鼠FSHR基因的核苷酸序列进行同源性比较。

　　1.2.2 睾丸总RNA提取 酒精浸泡小鼠数分钟，仰面固定，取出睾丸，去除白膜与大血管， 用TRIzol试剂提取睾丸总RNA，-80℃保存备用。

　　1.2.3 PCR引物设计 根据GeneBank/NCBI:NM_013523.2小鼠部分基因序列(2890aa)，经Primer Premier 5.0软件分析设计引物：

　　P2：CGCCTCGAGATCTGCCTCTATTACCTCCAAG，引物1和2分别引入EcoR I、Xho I酶切位点和保护性碱基，便于亚克隆，扩增片段长度186 bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.2.4 目的基因PCR产物的扩增和纯化 用MMLV逆转录酶合成cDNA第一链，20 μL体系：先将250 ng的随机引物、2 μL总RNA、1 μL 10 mmol/L dNTP混合物加入无核酸酶的微量离心管中，加灭菌蒸馏水至12 μL，混合物65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却。短暂离心后加入：4 μL 5×第一链合成缓冲液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RNaseOUTTM 核酸酶抑制剂(40 U/μL);在离心管中轻轻混和各种成分，并在37℃下孵育2 min。室温下加入1 μL MMLV逆转录酶，轻轻吹打混匀，在25℃下孵育10 min，最后37℃孵育50 min。采用20 μL反应体系，以2 μL cDNA(500 ng/μL)为模板，以 94℃5 min ;94℃30 s ，60℃30 s ， 72℃30 s ，扩增30个循环;最后72℃延伸7 min为条件扩增，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段大小。DNA凝胶纯化试剂盒凝胶回收扩增的PCR产物，-20℃保存备用。

　　1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 按分子克隆实验技术操作[5]。

　　1.2.6 原核表达载体pET32amFSHRn的构建 将PCR产物和pET32a载体用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，37℃分别酶切12 h和4 h。琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，回收产物用T4DNA连接酶按10∶1摩尔体系16 ℃连接过夜。连接产物转化感受态的大肠杆菌DH5α， 于100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养后，先进行菌落PCR筛选阳性克隆菌，用无菌牙签分别挑取单个菌落，浸泡在20 μL 0.1%Triton液中置100℃加热2 min。取2 μL作模板进行PCR扩增，将筛选阳性克隆菌接种于含相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37℃振荡培养12 h，提取质粒后EcoR I、Xho I双酶切鉴定筛选阳性克隆，最后对阳性克隆的插入片段送北京奥科生物公司测序。测序正确的质粒命名为pET32amFSHRn。

　　1.2.7 mFSHRn硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白的诱导表达与鉴定 以鉴定正确的重组表达质粒转化感受态的E. coli BL21(DE3)， 取菌液涂于含50 mg/L氨苄青霉素的LB平板上， 挑取单菌落， 接种于含相同浓度的氨苄青霉素的LB 液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。按1%转种后， 37℃振荡培养4～5 h至A600 = 0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1 mmol /L， 继续培养5 h，于诱导第3、5小时分别取1 mL 菌液，离心收集细菌，用TE重悬细菌，并加适当的蛋白上样缓冲液，煮沸15 min后进行15%的SDSPAGE电泳鉴定，确定有无蛋白表达。用HIS抗体进行Western bloting检测[6]。

　　2 结果

　　2.1 生物信息学分析

　　运用Vector NTI 9.0软件综合分析mFSHRn克隆片段的抗原性、柔韧性、亲水性和极性区域，并对其二级结构进行预测结果显示:抗原性区域：1620aa，2529aa，3236aa，38 42aa，43 47aa，5357aa，63 67aa;柔韧性区域：1519aa，2226aa，4049aa，58 62aa;极性区域：1620aa，1922aa，2226aa，2629aa，2935aa，39 43aa，43 47aa，5358aa，5867aa;亲水性区域：1115aa，2939aa，41 45aa，6367aa，6670aa;β转角区域：1519aa，2227aa，4448aa，4953aa，60 64aa;综合以上参数，推测最可能的抗原肽段是：1520aa， 2227aa，3236aa，42 48aa，58 67aa。

　　2.2 mFSHRn基因PCR产物的扩增、构建载体的鉴定

　　使用特异性引物对mFSHRn基因进行RTPCR扩增，得到约186bp的片段，将其插入原核表达载体pET32a中构建重组表达载体pET32amFSHRn。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后， 出现约5 900 bp和186 bp的条带， 前者为双酶切后的载体片段， 后者为双酶切后的目的DNA片段(图1) 。测序结果同预期的完全一致，部分测序图谱见图2， 表明重组表达载体pET32amFSHRn构建成功。

　　2.3 诱导蛋白的表达

　　SDSPAGE分析，与对照相比，诱导表达的pET32amFSHRn在相对分子质量约28kD处有明显的特异性条带， Western bloting结果确证有蛋白表达，说明成功的在大肠杆菌BL21(DE3) 表达体系中表达了mFSHRnTrx融合蛋白(图3) 。

　　3 讨论

　　目前，男性免疫避孕疫苗用于控制生育的研究越来越得到重视，相关的疫苗种类也有很多研究，实验方法也得到很多改进，例如促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗在提高疫苗的抗原性以及表达方面，实验设计时在序列GnRHI上融合Th和V5抗原表位，Th有助于增加疫苗的体液免疫反应，V5可提高融合蛋白的分泌表达，从而进一步促进疫苗的免疫活性[7，8]。但是疫苗的高效性、可逆性、安全性、对激素水平影响等方面仍存在不同程度的问题，近年来的相关研究表明特异性结合靶点疫苗的选择很重要。

　　FSHR N端多段肽片段是FSHR上的特异性结合区，对FSHR的免疫活性间接封闭FSH的生理作用从而影响精子的生成达到避孕的目的起决定作用，本研究针对mFSHR N端部分片段基因进行了生物信息学分析，表明此段有很好的抗原性，主要集中在1520 aa， 2227 aa，3236 aa，42 48 aa，58 67 aa。因此，本实验设计了一对特异性引物，从小鼠睾丸组织支持细胞中扩增出mFSHRn片段，将其插入原核表达质粒pET32a中，构建了重组表达载体，并在大肠杆菌中初步表达。

　　菌落PCR是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行扩增，用来鉴定和筛选阳性克隆菌的技术，筛选鉴定阳性克隆菌也可直接从扩增菌中提取质粒DNA，并以此为模板进行质粒PCR。但是菌落PCR可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力，另外对菌落经Triton预处理后再进行PCR可以明显提高实验筛选的阳性率，若以质粒PCR阳性率(100%)为对照，不经Triton处理直接用单个细菌菌落进行PCR鉴定，阳性率约为60%。而挑取单个菌落经Tritonx-100预处理后则阳性率提高到100%。

　　实验所选用的表达载体pET32a是一种融合表达载体，除能在外源蛋白的N端编码6个组氨酸残基外，还能够编码Trx，其与外源蛋白的融合表达可增加表达产物的可溶性，还可保护外源蛋白不易被降解。融合蛋白中的外源蛋白与Trx之间具有肠激酶和凝血酶的识别位点，可方便切下Trx，使表达的蛋白构像及活性与天然蛋白更接近，对于后续的蛋白免疫活性的研究有重要的作用。

　　FSHR存在几种不同形式的剪接变体[9]，但是相关的功能研究较少。本实验在pET32amFSHRn重组质粒构建过程中发现外显子2缺失的剪接变体形式(数据未列出)，扩增出的基因片段长度约125 bp左右。后续的实验将对mFSHRn及外显子2缺失剪接变体的抗体和蛋白纯化用于免疫避孕动物实验进行进一步的研究。

参考文献

1 梁小兵，周洁，刘学博，等. 卵泡刺激素受体主动免疫对雄性小鼠生育力影响的初步研究[J].生殖医学杂志，2000，9(4)：230233.

　　2 Abdennebi L， Chun EY， Jammes H， et al. Maintenance of sexual immaturity in male mice and bucks by immunization against Nterminal peptides of the folliclestimulating hormone receptor[J]. Biol Reprod， 2003， 68(1):323327.

　　3 Rao AJ， Ramachandra SG， Ramesh V， et al. Induction of infertility in adult male bonnet monkeys by immunization with phageexpressed peptides of the extracellular domain of FSH receptor[J]. Reprod Biomed Online， 2004， 8(4):385391.

　　4 Fan QR， Hendrickson WA. Structure of human folliclestimulating hormone in complex with its receptor[J]. Nature， 2005， 433(7023):269277.

　　5 Sambrook J， Fritsch EF， Maniatis T， et al.金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南[M]. 第2 版.北京:科学出版社， 1995. 55  56 ，322  323.

　　6 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 第2 版. 北京: 中国协和医科大学出版社， 1999.400 403.

　　7 Khan MA， Ogita K， Ferro VA， et al. Immunisation with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone(GnRHI) and Thelper epitopes in saline suppresses rodent fertility[J]. Vaccine，2008， 26(10)：1365-1374.

　　8 Khan MA，Ferro VA， Koyama S， et al. Immunisation of male mice with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone (GnRHI) and Thelper epitopes suppresses fertility in vivo[J]. Vaccine， 2007， 25(18):35443553.

　　9 TenaSempere M， Manna PR， Huhtaniemi I. Molecular cloning of the mouse folliclestimulating hormone receptor complementary deoxyribonucleic acid: functional expression of alternatively spliced variants and receptor inactivation by a C566T transition in exon7 of the coding sequence[J]. Biol Reprod， 1999， 60(6): 15151527.