肿瘤坏死因子α在铜绿假单胞菌肺炎中的变化及意义

【摘要】 目的：探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)在铜绿假单胞菌肺部感染发病中的作用。 方法: 90只小鼠随机分成对照组、模型组与抗体组，每组30只。通过气管插管，在气管内注入铜绿假单胞菌建立小鼠肺部感染模型，抗体组手术前6 h静脉内注入0.2 mL/kg TNFα抗体，对照组注入相同剂量的PBS液，分别在0、3、6、12、24 h不同时间点收集支气管肺泡灌洗液，用ELISA法检测各组不同时间点支气管肺泡灌洗液中TNFα的含量，并观察小鼠1周后的死亡率。结果：模型组和抗体组支气管肺泡灌洗液中TNFα含量在3 h时已开始升高，6 h达到高峰，12、24 h逐渐降低，模型组明显高于抗体组(P&<0.05～0.01)，而两组均显著高于对照组(P&<0.01)。1周后模型组小鼠死亡率(73.3%)明显高于抗体组(43.3%)(P&<0.01)，两组死亡率均显著高于对照组(3.3%)(P&<0.01)。结论:TNFα在铜绿假单胞菌肺炎发病过程中起着非常重要作用，抑制其过度释放可减缓病情.

【关键词】 肿瘤坏死因子α;铜绿假单胞菌肺炎;支气管肺泡灌洗液

　　 ABSTRACT] Objective: To investigate the role of tumor necrosis factorα(TNFα)in the course of pseudomonas aeruginosa pneumonia. Methods: 90 mice were randomly pided into three groups: model group， antibody group and control group. Pseudomonas aeruginosa strain was instilled into the trachea of the mice through tracheal cannula to induce pneumonia in each group. However， 6 hours before the instillation， TNFα antibody and PBS liquid were injected (0.2 mL/kg， iv) to the antibody group and the control group， separately. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were harvested at 0 h， 3 h， 6 h， 12 h， 24 h after pneumonia was induced， and measured for the TNFαconcentration with enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) in each group. Results: In both model group and the antibody group， TNFαlevel of BALF started to increase gradually 3h after pneumonia onset， reached the peak at 6h， decreased after 12h， and were significant higher than that of the control group (P&<0.01). Between the model group and the antibody group， TNFα level of the former was significant higher (P&<0.05～0.01). After a week， the mortality of the model group(73.3%) was significant higher than that of the antibody group(73.3%) and the control group(3.3%)， among the latter two， antibody group showed higher mortality(P&<0.01). Conclusion: Suppression excessive TNFα release can relieve pneumonia， as TNFαhas an important role in the course of pseudomonas aeruginosa pneumonia.

　　[KEY WORDS] Tumor necrosis factor(TNFα); Pseudomonas aeruginosa pneumonia; BALF

　　铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa， PA)为条件致病菌，是引起医院获得性肺炎特别是ICU患者的首要病因，在医院内最易受到PA感染的是中性粒细胞减少和进行机械通气的患者，其死亡率可超过30%[1]。而呼吸机相关性肺炎患者中的发生率更高，Chastre等[2]对2 490株来自1 689例通气患者的菌株进行分析发现，PA为最主要的革兰氏阴性菌(24.4%)[2]。PA也是囊性纤维化患者慢性肺部感染的主要原因[3]。与PA感染相关的肺损伤是细菌致病因素和过度宿主免疫反应的结果，宿主免疫反应有多种炎症介质参与，作用复杂，兼有保护和损害作用， 对肺部感染结局有重要作用[4]。本实验通过观察小鼠铜绿假单胞菌肺部感染时支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα) 的变化，探讨TNFα在铜绿假单胞菌肺炎发病中的作用，以期能找到更多途径进行干预。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　5周龄小鼠90只，清洁级Balbc，雌性，15～18 g，购于中山大学医学院实验动物中心，按随机数字表方法分成对照组、模型组与抗体组，每组30只。

　　1.2 PA菌株

　　标准菌株ATCC27853由复旦大学附属中山医院临床微生物实验中心提供，在MH琼脂中-70℃冻存。复苏：划线接种于琼脂平板，CO2孵箱37℃中培养24 h，每24小时转种1次以保持PA活性。使用前1～2 h，采用麦氏管目测法和分光光度仪比色法，用无菌双蒸水配成2个麦氏单位浓度(6×108 CFU/mL)。

　　1.3 肺炎模型的建立

　　用乙醚吸入麻醉后，沿小鼠颈正中皮肤切开并开胸，从甲状腺水平将气管剪开一小口，插入输液用16号针头并结扎固定，针头后软管接注射器，每只小鼠从气管内直接灌入0.2 mL麦氏单位菌株，然后缝合。对照组注入相同剂量的无菌PBS液;抗体组手术前6 h静脉内注入0.2 mL/kg TNFα抗体(购于上海晶天生物科技有限公司，美国Bioworld公司生产)。

　　1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集与处理

　　分别在注入菌株后0、3、6、12、24 h在右侧肺组织行支气管肺泡灌洗，用生理盐水反复肺灌洗3次，每次灌洗量为3 mL，停留1 min，反复3次，回收量&> 9O% ，收集BALF， 1 000 r/min离心10 min，13 000×g离心30 min，取其上清液以备检测。

　　1.5 TNFα测定

　　采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNFα，先包被TNF单克隆抗体(单抗)于PVC板上，样品中的TNFα与单抗结合后，再与辣根过氧化酶标记的兔抗TNFa多克隆抗体(多抗)结合，过氧化酶与底物反应，终止后用酶联免疫测定仪(酶标仪)测定450 nm 处吸光度值，结果与标准曲线比较，测定TNFα含量。TNFα试剂盒购于深圳晶美生物技术有限公司，为美国GeneMay公司生产。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，计量资料的比较采用方差分析，率的比较采用χ2检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同时间点各组小鼠BALF中TNFα含量的比较

　　3组0 h时TNFα的含量差异无统计学意义(P&>0.05)，3 h时模型组和抗体组TNFα含量已开始升高，6 h达到高峰，12、24 h逐渐降低，两组各时间点与0 h比差异有统计学意义(P&<0.01);对照组各时间点差异无统计学意义(P&>0.05);模型组3、6、12、24h各时间点TNFα含量较抗体组明显升高(P&<0.05～0.01)，两组均明显高于对照组(P&<0.01)(表1)。表1 各组小鼠不同时间点BALF中TNFα含量的比较

　　2.2 各组1周后的死亡率

　　1周后模型组的死亡率(73.3%，22/30)明显高于抗体组(43.3%，13/30)和对照组(3.3%，1/30)(P&<0.01)，两组的死亡率明显高于对照组(P&<0.01)。

　　3 讨论

　　PA是引起免疫功能低下和机械通气患者肺部感染最主要而且最重要的菌株，其耐药率极高，即使使用强力且药敏针对性强的抗感染药物，死亡率仍居高不下，是临床医师尤其是ICU医师最棘手、最迫切需要解决的问题。PA感染相关的肺损伤是细菌致病因素和过度宿主免疫反应的结果[4]，其致病因素有细菌鞭毛、纤毛、脂多糖和细菌各种分泌产物，如胞外产物、Ⅲ型分泌蛋白[5]及藻酸盐。宿主免疫包括固有性免疫反应和适应性免疫反应，有多种免疫细胞、免疫分子和炎症介质的参与。我们在注重抗感染杀灭细菌的同时，也应该关注宿主对免疫的反应，进行免疫方面的调节，也许能增强疗效，提高治愈率。本实验制备了小鼠PA肺炎模型，对其BALF中的TNFα进行了检测，发现PA导致的肺部感染后3 h已明显升高，6 h达到高峰，以后逐步下降，但24 h仍然升高明显，与致病前0 h有显著性差异(P&<0.01)，这说明PA肺炎时有TNFα激活、大量分泌。TNFα是炎症反应最早、最主要的炎症因子，主要是由活化的单核巨噬细胞产生的一种细胞因子， 它通过刺激血管内皮细胞表达黏附分子， 使之易黏附于白细胞， 刺激单核吞噬细胞和其它细胞分泌趋化性细胞因子，如白细胞介素(IL1)，而IL1随后又刺激产生其他细胞因子的生物合成并反过来增强组织细胞对TNFα的敏感[6]，引起白细胞在炎症部位的聚集。许多研究提示TNFα在激活炎性白细胞从而清除细菌中起关键作用， 可增强局部的抗感染免疫能力[7]。此外， 研究还发现TNF基因敲除的小鼠对微生物引起的局部感染的控制能力大大降低[8]，然而TNFα的持续激活、大量分泌TNFα能介导肺损伤[9]。本实验发现事先加入抗TNFα抗体的PA肺部感染小鼠其BALF的TNFα明显低于未加入抗体小鼠，其1周后死亡率也明显低于后者，但两组小鼠病死率均显著高于对照组，说明过度释放也可导致肺炎加重，增加死亡率，减少TNFα的释放能明显改善预后。这说明PA感染小鼠肺部后，刺激机体分泌大量TNFα，导致过度宿主免疫反应，免疫失衡，引起严重肺免疫损伤。张青等[10]报道TNFα对肺有强烈的毒性，能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏，积聚的水肿液进一步阻碍了肺泡细胞的灌流和氧气交换，引起急性呼吸窘迫综合征。因而抑制TNFα过度释放，减轻过强的免疫反应对机体的损伤，有助于PA肺部感染的预后。

参考文献

1 Giamarellou H. Therapeutic guidelines for Pseudomonasaeruginosa infections[J].Int J Antimicrob Agents，2000，16(2)：103106.

　　2 Chastre J，Fagon JY.Ventilator associated pneumonia[J].Am J Respir Crit Care Med，2002，165(7)：867903.

　　3 Hoiby N，Frederiksen B. Microbiology of cystic fibrosis.In：Hodson ME，Geddes DM， eds.Cystic fibrosis[M].London：United Kingdon，2000.83107.

　　4 Kanangat S，Meduri GU，Tolley EA，et a1.Effects of cytokines and endotoxin on the intracellular growth of bacteria [J]. Infect Immun，1999，67(6)：28342840

　　5 RoyBurman A，Savel RH，Racine S，et a1.Type Ⅲ proteinsecretion is associated with death in lower respiratory andsystemic pseudomonas aeruginosa infections[J].J Infect Dis，2001，183(12)：17671774.

　　6 Tracey KJ，Beutler B，Lowry SF，et a1.Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin[J].Science，1986，234(4775)：470474.

　　7 Sadikot RT，Blackwell TS，Christman JW，et a1.Pathogenhost interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia[J].Am J Respir Crit Care Med，2005，171(11)：12O91223.

　　8 Morissette C，Francoeur C，DarmondZwaig C，et a1.Lung phagocyte bactericidal function in strains of mice resistant and susceptible to Pseudomonas aeruginosa[J].Infect Immun，1996，64 (12)：49844992.

　　9 高桂新，沈华浩.感冒双解合剂对流感病毒FM1感染小鼠肺部炎性损伤的影响[J].中国病理生理杂志，2007，23(6)：11371140.

　　10 张青，毛宝龄，钱桂生，等.油酸内毒素序贯致伤大鼠血浆和肺泡灌洗液TNFα、IL1 和IL6水平的变化[J].第三军医大学学报，2004，26(15)：13541356.