AMI患者血清瘦素及外周血单个核细胞内皮素受体mRNA的检测

【摘要】 目的：探讨急性心肌梗死(AMI)患者血清瘦素(Leptin， LP) 水平的变化及外周血单个核细胞内皮素受体(ETAR)mRNA的表达和临床意义。方法:采用酶联免疫法测定65例AMI患者和70例健康对照组血清LP水平;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定ETAR mRNA的表达。结果:AMI患者在&<6 h 、&>6 h、24 h采血，LP水平随时间的延长而增高，24 h达到高峰，48 h后反而下降。6 h内与48 h组LP水平与对照组相比，差异有统计学意义 (P&<0.05);&>6 h、24 h组与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.01);6 h内与48 h组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。AMI患者ETAR mRNA的表达明显增高，随时间的延长变化不明显，维持在一个较高的水平。与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.01);AMI组内相比差异无统计学意义(P&>0.05)。经直线相关分析：LP水平与ETAR mRNA的表达无相关性(P&>0.05)。结论:AMI患者血清LP水平及ETAR mRNA的表达明显升高，分别是AMI发生的重要的独立危险因素及预测因子，早期监测LP水平及ETAR mRNA的表达，有利于AMI的预防。

【关键词】 急性心肌梗死;瘦素;内皮素受体mRNA;酶联免疫法;逆转录聚合酶链反应

　　[ABSTRACT] Objective: To explore serum leptin levels and expression of endothelin A receptor(ETAR) mRNA in peripheral blood monocytes in patients with acute myocardial infarction(ASMI). Methods: The level of serum LP was assayed by enzymelinked immunosorbent assay in 65 cases with AMI and 70 healthy cases in control group. The expression of ETAR mRNA was assayed by RTPCR. Results: Compared with control group， there was significant increase in serum LP levels at &<6h and 48h in AMI group (P&<0.05); there was significant difference at &>6h and 24h in AMI group(P&<0.01)， and there was no significant difference at &<6h and 48h in AMI group (P&>0.05). The expression of ETA  R mRNA was significantly increased in AMI patients， remaining a high level (P&<0.01).Linear correlation analysis showed that there was no correlation between LP and ETAR mRNA expression (P&>0.05).Conclusion: The serum LP levels and ETAR mRNA expression were significantly increased in AMI patients， and they are important risk and predictive factors for AMI patients. Monitoring the level of the LP and ETAR mRNA expression as early as possible is favorable to the prevention of AMI.

　　[KEY WORDS] Acute myocardial infarction; Leptin; EndothelinA receptor mRNA; ELIAS; PCR

　　急性心肌梗死(AMI)是严重危害人类健康的疾病，其病理、生理基础是不稳定斑块的破裂，此现象的发生与内皮素及其受体有密切的关系[1，2]。血清瘦素(LP)作为一种参与摄食、能量代谢和体重调节的重要细胞因子，在心血管病发病过程中的作用越来越成为研究的热点。是AMI发生的独立危险因素，是预测AMI的指标。AMI发生时，LP及ETAR mRNA在不同的发病时间，其表达水平怎样，相关性如何?本研究基于这些问题，动态观察了AMI患者不同时间的LP水平和ETAR mRNA的表达情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例选择

　　所有患者均为2008年3月～2008年12月海南医学院附属医院、海南省人民医院心内科确诊的AMI患者65例，其中男性43例，女性22例，平均年龄(58.6±7.5)岁。全部符合临床诊断标准[3]。心肌梗死部位：前壁梗死26例，间壁梗死13例，下壁梗死19例，侧壁梗死7例。发病时间在6 h以内者52例，超过6 h者13例。健康对照组来自同期海南医学院附属医院体检中心体检者70例，其中男性43例，女性27例，平均年龄(56.4±5.2)岁。所有对象应排除急、慢性感染性疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。患者分别于入院时、24 h、48 h采血5 mL;正常对照组清晨空腹采血5 mL。

　　1.2 试剂与仪器

　　1.2.1 仪器 酶标仪(美国宝特ELx-800)，低温冰箱(青岛海尔)，离心机(安徽科大创新有限公司中佳分公司KDC1042)，PCR扩增仪(上海朗赋实业有限公司)，高速离心机(中国湘仪)。

　　1.2.2 试剂 瘦素(美国DSL);ETA  R mRNA试剂盒(美国GIBCO);ETA  R mRNA引物及Marker(上海生物技术工程有限公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 单个核细胞分离 取EDTA抗凝静脉血5 mL，加淋巴细胞分层液，室温下1 800 r /min离心20 min，分离单个核细胞，用无钙镁磷酸缓冲液洗3次备用。

　　1.3.2 总RNA提取 10 ×106单个核细胞加入Tris 1 mL，反复吹打细胞，室温放置5 min，加入0.2 mL氯仿，用力振荡15 s，放置2～3 min，12 000 r/min， 4 ℃离心5 min。去上层水相加入等量异丙醇，颠倒混匀，放置5 min，12 000 r /min，4 ℃离心5 min。弃上清，用70%乙醇1 mL溶解沉淀，12 000 r /min， 4 ℃离心2 min。弃上清，重复1次，沉淀即为总RNA。将其干燥，溶解于40 μL RNA Free水，-70 ℃冰箱保存。

　　1.3.3 RTPCR ETAR mRNA引物序列:上游: 5′CACTGGTTGGATGTGTAATC3′;下游: 5′GATACACCAGTAACTAGAGGC3′，367 bp;βactin引物序列：上游: 5′GTGCTACGTCGCCCTGGACTTGG3′;下游：5′GAGGTAGGACCG GAGCGACAGGTG3′，263 bp。按一步法RT  PCR说明书进行加样操作。扩增产物进行电泳检测，用凝胶图像分析仪进行积分光密度(D)扫描并计算每一阳性条带与其内参照比值的相对含量。

　　1.4 统计学处理

　　所得数据采用SPSS11.5软件进行分析，数据以(±s)表示，均数的比较采用t检验;LP水平与ETAR mRNA表达的相关性采用直线相关分析，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 LP水平的检测

　　AMI患者在&<6 h 、&>6 h、24 h采血，LP水平随时间的延长而增高，24 h达到高峰，48 h后反而下降。6 h内与48 h组血浆LP水平与对照组相比，差异均有统计学意义(P&<0.05);&>6 h、24 h组与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.01)。6 h内与48 h组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　2.2 ETAR mRNA的表达情况

　　AMI患者在不同的时间ETAR mRNA的表达均明显增高，但随时间的延长变化并不明显，始终维持在一个较高的水平。与对照组相比，差异均有统计学意义(P&<0.01);AMI组不同时间组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　2.3 LP水平与ETAR mRNA表达的相关性分析

　　经直线相关分析：LP水平与ETAR mRNA的表达无相关性(P&>0.05)(表1)。表1 AMI组和对照组LP和ETAR mRNA表达水平的检测

　　3 讨论

　　Meisel[4]等报道，AMI患者发病第1天时血清LP即高于正常水平2倍以上，在AMI的发生中起重要作用，本研究结果支持此结论。AMI患者LP水平24 h内随时间的延长而增高，48 h后反而下降。24 h内LP的水平高于健康对照组近3倍，48 h后略有下降，但仍保持在一个较高的水平。提示LP的增高与AMI的病理、生理变化密切相关。瑞典的一项病例对照研究揭示，首次发生急性心肌梗死的62名男性，同其年龄、性别、地区、健康检查日期及类型匹配的对照组相比，血浆瘦素水平明显升高;条件logistic回归分析证明瘦素是急性心肌梗死的危险因素(OR= 8.9)。AMI后LP水平增高的主要原因可能为某些炎性因子的刺激，交感神经系统兴奋性增高，使LEP分泌增加，以适应应激的需要。但LP是否作为一种独立的AMI危险因子，或者LP升高是否作为一种损伤性抑或对心脏有保护作用的机制， 需要深入研究。

　　AMI的发生于内皮素及其受体有密切的联系，ETAR与ET结合后通过磷脂酶C途径，导致血管平滑肌收缩;磷脂酶D途径，促进原癌基因cfos、cmyc等的表达，促进血管平滑肌细胞的增殖，加重AMI患者的心肌缺血;通过磷脂酶A2途径，使氧自由基增加，导致心肌细胞的损伤和坏死，促进血栓素和白三烯的生成，引起血栓形成，加速AMI的发生、发展。心肌缺血、缺氧及自由基可上调ETAR mRNA的表达。本研究显示，AMI患者在48 h内ETAR mRNA的表达均明显增高，但随时间的延长变化并不明显，始终维持在一个较高的水平。说明ETAR mRNA的高表达可能是AMI发生的危险因素，早期应用ETA的拮抗剂可能是AMI治疗的一个新靶点。

　　Quehenberger 等[5]将瘦素与人脐静脉内皮细胞一起孵育后，ET1的mRNA表达和蛋白分泌增加，充分证明LP可以促进ETAR mRNA的增加，使其维持在一个较高的水平。但LP与ETAR mRNA的相关性如何呢?本研究显示，LP水平与ETAR mRNA的表达无相关性。说明LP和ETAR mRNA可能为AMI发生的独立危险因素。由于本研究例数不多，该结论有待进一步研究证实。

参考文献

　1 Browatzki M， Schmidt J， Kubler W， et al. Endothelin1 induces interleukin6 release via activation of the transcription factorNF  kappa B in human vascular smooth muscle cells[J]. Basic Res Cardiol，2000，95(2):98.

　　2 叶任高，陆再英.内科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社，2004.290291.

　　3 Yamamoto Y， Ikegaki I， Sasaki Y， et al.The protein kinase inhibitor fasudil protects against ischemic myocardialinjury induced by endothelin1 in the rabbit[J]. J Cardiovasc Pharmacol， 2000，35(2):203.

　　4 Meisel SR， Ellis M， Pariente C， et al. Serum leptin levels increase following acute myocardial infarction[J].Cardio logy，2001，95:206211.

　　5 Queheberger P， Exner M， Sunder PR， et al.Leptin induces endothelin1 in endothelial cells in vitro[J].Circ Res，2002，90(6):711718.