应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变

　　　　 作者：周代锋，蔡望伟，云美玲，张勇，习隽丽 ，王镇

【摘要】 目的：建立检测胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)基因6种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术，对海南汉、黎族人群中CETP基因突变类型进行了检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果：在海南汉、黎族人群中，TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA 3种基因型，I405V(A→G) 突变位点可检测出AA、AG、GG 3种基因型，D442G(A→G) 突变位点可检测出AA、AG 2种基因型，但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型，用等位基因特异性PCR鉴定的CETP基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好，可作为鉴定CETP基因突变类型的可行方法。

【关键词】 胆固醇酯转运蛋白基因;等位基因特异性;聚合酶链反应;基因分型

　　[ABSTRACT] Objective: To establish the allele specific polymerase chain reaction (ASPCR) technique for the detection of 6 normal mutations of cholesterol ester transfer protein (CETP) gene. Methods: Designed the ASPCR system according to the 6 mutations of CETP gene， TaqIB (G→A)， I405V (A→G)， D442G (A→G)， R451Q (G→A)， A373P (G→C) and I14A (G→A). Detected the mutations in Li and Han nationalities of Hainan province by the designed method and sequenced partial mutation samples. Results: 3 genotypes were successfully detected in TaqIB(G→A) mutation site which were GG，GA，AA， 3 genotypes were successfully detected in I405V(A→G) mutation site which were AA，AG and GG， and 2 genotypes were successfully detected in D442G(A→G) mutation site which were AA and AG， while only the wild genotype could be detected separately in R451Q(G→A)，A373P(G→C) and I14A(G→A) mutation sites which was GG. All the results above provided by the ASPCR were exactly consistent with the sequencing results. Conclusion: The ASPCR with advantages of stability and simplify is an effective method for investigation of the mutations of CETP gene.

　　[KEY WORDS] Cholesterol ester transfer protein (CETP) gene; Allele specific(AS); Polymerase chain reaction(PCR); Genotyping

　　胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein， CETP)通过介导胆固醇酯(cholesterol ester，CE) 在高密度脂蛋白(high density lipoprotein， HDL) 和富含载脂蛋白B的脂蛋白之间的交换，在胆固醇逆向转运过程中起着关键的作用，与动脉粥样硬化(arteriosclerosis，AS)的发生、发展密切相关[1]。CETP 基因存在着多种变异，影响CETP 的浓度和活性，引起机体的脂代谢异常。为了研究海南汉、黎族人群中CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种突变类型的频率，笔者建立了简便、快速检测CETP基因上述6种突变的等位基因特异性PCR技术，现将结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 DNA样品

　　用EDTA抗凝，从海南省海口市、文昌市随机采集海南籍汉族正常人群血液样本301份，从海南省保亭、白沙、昌江、陵水、琼中等市县随机采集海南籍黎族正常人群的血液样本330份，以上样本均为血缘上的无关个体，按Lahiri等方法[2]提取DNA。

　　1.2 等位基因特异性PCR扩增CETP基因

　　1.2.1 引物的设计与合成 从Genbank中获得人类CETP基因的DNA全序列和mRNA序列，用PCR DESN软件辅助设计引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。表1 等位基因特异性PCR的引物序列、退火条件及扩增片段长度

　　 1.2.2 PCR扩增 每个突变位点都设立2个PCR检测管，分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个突变位点突变和正常的等位基因。每管在1×PCR缓冲液(10 mmol/L TrisHCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5～2.0 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg，每种引物0.2～0.5 μmol/L，每种dNTP为200 μmol/L，在加入1 U Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)后，置Tgradient 96梯度PCR仪中扩增， PCR扩增循环参数如下：首先在94 ℃进行2 min的热变性，随后进行32个循环反应(每个循环包括94 ℃ 50 s，退火条件见表1，72 ℃ 60 s)。将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec 公司产品)中观察结果并照相。

　　用上述建立的等位基因特异性PCR技术对301例海南汉族人样本DNA和330例海南黎族人样本DNA进行了CETP基因的检测。

　　1.3 CETP基因PCR扩增结果的DNA测序验证

　　随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种CETP基因型的DNA样本，将表2中引物的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。表2 DNA测序特异片段PCR扩增的引物序列、退火条件及扩增片段长度

　　2 结果与分析

　　2.1 6种常见CETP基因突变位点的基因分型结果

　　每种CETP基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。

　　应用建立的等位基因特异性PCR技术对301例海南汉族人样本DNA和330例海南黎族人样本DNA进行了CETP基因的检测。在海南汉、黎族人群中，TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA 3种基因型，I405V(A→G) 突变位点可检测出AA、AG、GG 3种基因型，D442G(A→G) 突变位点可检测出AA、AG 2种基因型，但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型 (图1，2)。

　　2.2 CETP基因PCR扩增结果的DNA测序验证

　　2.2.1 CETP基因突变位点特异DNA测序片段PCR扩增结果 应用表2中的测序引物对经等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种CETP基因型的DNA样本进行PCR扩增，获得特异DNA测序片段(图3)。送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。

　　2.2.2 CETP基因突变位点特异DNA片段测序结果 将经测序引物扩增获得的特异DNA测序片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。测序结果表明等位基因特异性PCR技术对CETP基因的分型结果与DNA测序结果完全相符(图4～9)。

　　3 讨论

　　CETP是由476个氨基酸残基组成的疏水糖蛋白，是脂代谢过程中重要的脂转移蛋白，主要介导胆固醇的逆向转运，使外周组织和细胞内多余的胆固醇通过HDL运回肝脏代谢，加速外周组织胆固醇的流出，维持细胞内胆固醇的稳定。CETP基因位于人染色体16q1221，长25 kb，含16个外显子和15个内含子，CETP基因表达对脂质转运活性及体内

　　注:M为100 bp DNA Ladder(北京天根公司产品，后同)， 1与2、3与4、5与6分别为TaqIB(G→A)突变位点GG、GA和AA基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果;7与8、9与10分别为D442G(A→G)突变位点AA和AG基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果;11与12为A373P(G→C)突变位点GG基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果。

　　图1 CETP基因TaqIB(G→A)、D442G(A→G)和A373P(G→C)突变位点基因分型的PCR扩增结果 注：M为100 bp DNA Ladder， 1与2、3与4、5与6分别为I405 V(A→G)突变位点AA、AG和GG基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果;7与8为R451Q(G→A)突变位点GG基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果，9与10为I14A(G→A)突变位点GG基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果。

　　图2 CETP基因I405V(A→G)、R451Q(G→A)和I14A(G→A)突变位点基因分型的PCR扩增结果

　　注:M为500 bp DNA Ladder，13、46、79、1012分别为TaqIB(G→A)突变位点、I405V(A→G)与I14(G→A)突变位点、D442G(A→G)与R451Q(G→A)突变位点、A373P(G→C)突变位点的DNA特异测序片段。

　　图3 CETP基因测序位点PCR扩增结果

　　图4 CETP基因TaqIB(G→A)突变位点3种基因型测序结果

　　图5 CETP基因I405V(A→G)突变位点3种基因型测序结果 图6 CETP基因D442G(A→G)突变位点2种基因型测序结果

　　图7 CETP基因R451Q(G→A)突变位点GG基因型的测序结果 图8 CETP基因A373P(G→C)突变位点GG基因型的测序结果 图9 CETP基因I14A(G→A)突变位点GG基因型的测序结果 脂蛋白组成起着决定性作用[3，4]。CETP基因在多个位点上存在着多态性，近年来，CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)多态性与冠心病、动脉粥样硬化等疾病的相关性研究已成为国内外研究的热点[1，5，6]。

　　等位基因特异性PCR又称为扩增不应突系统PCR(ARMSPCR)或3'碱基特异的PCR，是近20年来发展起来的主要用于检测DNA上点突变的一项技术，其基本原理为[79]：PCR对引物3'端与模板的互补性要求较高，只要3'端序列有一个碱基错配即可使PCR的扩增效率降低。设计引物时，要同时设计针对正常和突变序列的两条引物。正常序列引物与正常模板互补，而突变序列引物与突变模板互补。若只有正常引物能扩增，则提示无相应突变。若只有突变引物扩增，则提示受检标本为突变的纯合子。若正常与突变引物都能扩增，则提示受检标本为突变的杂合子。由于CETP基因的突变以点突变为主，因此，非常适合用ARMS法对CETP基因的突变进行检测。目前国内主要应用PCRRFLP连锁分析对CETP基因的基因突变类型进行检测[1015]，应用等位基因特异性PCR直接检测CETP基因的突变未见文献报道。

　　本文应用建立的等位基因特异性PCR技术对301例海南汉族人样本DNA和330例海南黎族人样本DNA进行了CETP基因的检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果表明，在海南汉、黎族人群中，TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA 3种基因型，I405V(A→G) 突变位点可检测出AA、AG、GG 3种基因型，D442G(A→G) 突变位点可检测出AA、AG 2种基因型，但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型。其基因分型结果与DNA测序结果完全相符，说明基因分型结果的特异性和准确率均较高。

　　在等位基因特异性扩增反应中，在PCR扩增引物的3'端引入不匹配碱基，会部分降低扩增的效率，但可以选择性地使目的基因型片段得到有效扩增[16]。基于这一原理，在检测每一个CETP基因突变位点的两条特异性引物的3'端倒数第三或第四位均引入了一个不匹配碱基，使得引物延伸的特异性大大提高，降低了用等位基因特异性PCR检测CETP基因突变的假阳性率。此外，在全部PCR反应中同时扩增了CETP基因的一个922 bp的片段作为内对照，用以判断样品DNA的完整性和PCR的质量。

　　本文建立的等位基因特异性PCR技术，对CETP基因分型稳定，具有重复性好、特异性和准确率均较高的特点，为开展CETP基因的研究提供了简便、快速、准确的基因分析方法。

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