【关键词】 解偶联蛋白;缺血再灌注损伤;肝脏
解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCP)位于线粒体内膜上，是线粒体阴离子载体蛋白大家族(mitochondrial anion carrier proteins，MACP)的成员，目前已知有5种。在缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)中，线粒体解偶联蛋白通过解偶联作用减少细胞内ROS(reactive oxygen specie，活性氧簇)的产生，在一定程度上减轻了脂质过氧化反应，起到保护细胞的作用。但是由于解偶联使得细胞内的ATP的合成减少，在细胞急需能量是无法获得足够的ATP。目前对线粒体解偶联蛋白在各脏器缺血再灌注损伤中的作用存在争议。本文就解偶联蛋白的基因定位、蛋白的空间结构、不同组织表达的特异性等及其肝缺血再灌注损伤中的研究进行综述。
1 解偶联蛋白
目前已知有5种解偶联蛋白，包括UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5/ BMCP1。分子量大约在32kDa，其中UCP1、UCP2和UCP3分质量在31到34kDa之间，而UCP4和UCP5/ BMCP1在36到38kDa之间，分成3个结构域，每个结构域大约有100个氨基酸。解偶联蛋白都是碱性蛋白质，pHI大约为9。不同的UCP在不同组织具有表达的特异性。在5种解偶联蛋白中与缺血再灌注损伤相关的是UCP1、UCP2和UCP3。
1.1 解偶联蛋白基因的定位及在不同组织的表达 UCP1基因定位于4 号染色体q28-q31上，6个外显子和5个内含子。一般认为是在棕色脂肪组织中高表的。但是也有研究发现在皮肤衍生细胞中也表达，同时受到激素如去甲肾上腺素和9顺式维甲酸的调节[1]。
UCP2基因定位于11 号染色体q13[2]，基因全长8.7kb，包含8个外显子，7个内含子[3]。UCP2的mRNA广泛存在与人和啮齿类动物的大多数组织中，UCP2在多种组织如白色棕色脂肪组织、肌肉、心、肺、肾和淋巴细胞等均有表达[4]。
UCP3基因定位于11 号染色体q13[2]，与UCP2基因相距75～150kb。UCP3基因全长8.5kb，至少7个外显子，产生2个转录产物[5]，分别为短型UCP3(UCP3(S))和长型UCP3(UCP3(L))。其中UCP3(S)与UCP3(L)相比缺C乏端的外显子7。UCP3在骨骼肌中表达，其不同的亚型受到不同剪接因子的正调节。UCP3的选择剪接受到剪接因子ASF/SF2和转录因子PPAR-gamma的共同调节。ASF/SF2的活化生成的产物为长型UCP3(UCP3(L))，是通过抑制位于内含子中的断裂信号和加A信号，这些信号能过早终止信使RNA的延长。PPAR-gamma通过直接与ASF/SF2相互作用激活这个过程[6]。
UCP4基因定位于6号人类染色体q11.2-q12。 UCP4转录产物在胎儿和成人脑组织中高度表达，但是在脊索、髓质、胼胝体、黑质的表达丰度低[7]。
UCP5/BMCP1基因定位于大鼠X染色体上和人类Xq24。UCP5基因的转录产物在人类和小鼠多种组织中都表达，但是在脑和睾丸中高表达。Northern 分析小鼠、大鼠、人类的组织发现这个基因主要在脑中表达，而且是其他低表达组织的30倍。脑组织原位杂交分析，大脑皮层、海马、丘脑、杏仁核和下丘脑特别丰富[8]。
1.2 解偶联蛋白的空间结构 目前研究发现线粒体解偶联蛋白都是以同源二聚体的形式存在。每个亚基由3个结构域组成，每个结构域含有2个α螺旋，而α螺旋由亲水环连接。多肽链穿梭线粒体脂质双层6次(即6个跨膜片段)，氨基端和羧基端位于膜的胞浆侧，而亲水环位于线粒体基质侧。基于UCP1的每个亚基含6个跨膜片段，而且含有嘌呤核苷酸结合部位元件，当嘌呤核苷酸结合后对其活性有抑制作用的基础，Amalia Ledesma等[9]通过计算方法，同时考虑其生物化学和序列分析构建跨膜模型。其要点如下:(1)6个跨膜α螺旋(TMHs)连接形成一个反向螺旋管。(2)TMHs是两性分子，疏水氨基酸残基朝向脂双分子层。(3)在管的轴中，基质环(即亲水环)没有穿透。(4)轴的两极组成转运通道。光亲和标记和诱导突变研究确认有UCP1许多区域与核苷酸相互作用。但是Amalia Ledesma等构建的模型中核苷酸结合位在管轴的的内部。嘌呤环与基质环相互作用，而通过聚磷酸酯链与TMH中的精氨酸残基稳定相互作用，它的侧链朝向螺旋管轴。
1.3 解偶联蛋白在缺血再灌注损伤中的作用
1.3.1 解偶联作用 UCP促进阴离子从线粒体膜内侧向外侧转运和质子从线粒体膜外侧向内侧反向转运，从而破坏内膜两侧的质子电化学梯度，使ATP的生成受到抑制，以电化学梯度储存的能量以热能形式释放。Wan C等[10]用基因工程的方法增强和抑制UCP2的表达，研究它在肝细胞缺血中的作用，发现在转染了表达UCP2质粒的正常细胞组中ATP水平明显低于对照组，而在转染了RNAi质粒的脂肪肝细胞组中ATP水平明显升高。
1.3.2 抑制活性氧簇(ROS)的形成 细胞通过严格控制细胞内ROS的水平，从而维持氧化和抗氧化的平衡。器官缺血再灌注后，细胞内ROS和抗氧化剂的失衡使细胞处于氧化应激状态，能损伤到脂质、蛋白质、DNA等细胞的主要成分[11]。Bienengraeber M等[12]通过转染原型解偶联蛋白UCP1，心肌衍生细胞H9c2，减少活性氧簇的形成，提高心肌细胞生存率。Bouillaud F[13]研究认为UCP2在细胞代谢中起到重要作用。UCP2这个转运体的激活能减少线粒体从葡萄糖到丙酮酸的氧化作用。UCP2能使在需氧组织中的线粒体继续糖酵解。他认为UCP2不是一种生理相关的接偶联剂而是影响ROS产物的节约闸和葡萄糖传感器。Velloso LA等[14]UCP2在控制自由基产物，氧化损害和脂肪酸过氧化物的输出方面扮演重要角色。Echtay[15]认为UCP2可以将超氧阴离子从基质转运至内外膜间隙，再通过歧化物或辅酶Q(CoQ)等抗氧化物质的作用或质子化作用将其清除。
1.3.3 钙超载 线粒体内适量的Ca2+能激活三羧酸循环中的Ca2+调节酶。因此Ca2+在线粒体的代谢调节中起到重要作用[16]。但是线粒体必须在时空上有效调节Ca2+信号，否则线粒体将处在Ca2+的不利环境，而Ca2+超载将成为细胞的一个死亡因素[17]。Trenker M等[18] 通过过度表达、RNA干扰和诱导突变试验，在生理刺激细胞条件下，发现UCP2和UCP3是线粒体钙增加的基本因素。因此他们认为线粒体钙超载的本质是UCP2和UCP3的过度表达。
万赤丹等[19]对于解偶联蛋白的解偶联作用和抑制活性氧簇形成两个作用在器官缺血再灌注损伤中的主次要地位进行研究，发现解偶联作用占主导地位。UCP2过表达在一定程度上减少了细胞内ROS的增多，减少了脂质过氧化反应的产生，这对遭受缺血再灌注损伤的细胞来说是有利的一面。缺血再灌注损伤后，细胞在这种应激状态下对ATP消耗加速，ATP需求急剧增加，但是由于解偶联的增加，加剧了细胞内ATP的不足，使细胞赖以生存的能量无法补充，细胞的死亡率升高。
2 解偶联蛋白在肝缺血再灌注损伤研究进展
目前对肝缺血再灌注损伤中解偶联蛋白表达研究有两种截然相反的结果：(1)解偶联蛋白表达的上调，Serviddio G等[20]选择NASH(non-alcoholic steatohepatitis，非酒精性肝炎)病人和喂养缺乏甲硫丁氨酸和胆碱饮食的大鼠进行缺血再灌注损伤实验。在缺血再灌注损伤前后从肝组织中提取线粒体进行分析，发现UCP2上调、质子漏出、过氧化氢产物增多、总ATP下降。分析认为NASH线粒体质子漏出率增加和总ATP下降均是UCP2上调的结果。UCP2的上调在一定程度上降低了NASH病人和大鼠线粒体呼吸链氧化还原的压力，但是在缺血再灌注损伤中危害了肝脏对能量需求的增加。(2)解偶联蛋白表达的下调，Cheng G等[21]用氧化磷酸化解偶联剂FCCP模拟肝细胞缺氧再复氧损伤，发现肝细胞株HEP6-16内的ATP水平下降与FCCP的剂量和作用时间有依赖性，而且ATP水平下降伴随着UCP2mRNA的下降。当去除FCCP，将细胞培养于正常的培养液中，ATP和UCP2mRNA在几个小时内就恢复正常。
用基因工程对增强或抑制甚至去除解偶联蛋白的表达研究对缺血肝细胞再灌注损伤的影响：(1)增强解偶联蛋白表达 最常用的方法是将含有解偶联蛋白靶基因的质粒转染肝细胞。Wan C等[10]将含有UCP2靶基因的表达质粒转染入正常的肝细胞，体外建立缺血再灌注损伤模型。通过与正常肝细胞和转染了空载体的正常肝细胞比较，1、6、12、24h缺血再灌注后， ATP、ROS和MDA水平和生存率显著降低，细胞坏死率显著升高，但是细胞凋亡率并没有显著差别。(2)抑制甚至去除解偶联蛋白表达 目前主要是通过基因敲除和RNA干扰的方法实现的。Evans ZP等[22]选择ob/obUCP-2基因敲除的小鼠进行全肝缺血再灌注损伤实验。虽然ob/obUCP-2基因敲除的小鼠和ob/ob小鼠最初的表现型相似，但是24h再灌注后ob/obUCP-2基因敲除的小鼠生存率为83%，而ob/ob小鼠生存率30%。ob/obUCP-2基因敲除的小鼠与ob/ob的小鼠相比，缺血后血清ALT浓度和肝细胞肿胀坏死降低。再灌注后，ob/obUCP-2基因敲除的小鼠与ob/ob的小鼠相比肝ATP水平增加，但是与正常肝相比仍维持在低浓度。而Wan C等[11]用RNAi质粒转染脂肪肝细胞，干扰细胞的UCP2的表达。与脂肪肝细胞相比，6、12、24h缺血再灌注损伤中， ROS和MDA水平及细胞凋亡率没有显著差别(P&>0. 05)，但是在ATP水平及细胞生存率明显升高(P&<0.05)。通过基因工程方法抑制UCP2在肝细胞中的表达能提高肝细胞的ATP水平和生存率，而增强其表达则减低肝细胞的ATP水平和生存率。
3 结 语
本文在阅读许多文献的基础上，阐述了线粒体解偶联蛋白的基因定位、蛋白质空间结构和在不同组织表达的特异性等及其在肝缺血再灌注损伤的研究进展。在肝脏缺血再灌注损伤研究中认为UCP2的高表达对肝脏起到损害作用，但是肝缺血再灌注后UCP2是升高还是降低存在争论。目前关于这方面的研究不多，随着研究的深入，UCP2可能成为调节肝缺血再灌注损伤的靶基因之一。
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