【摘要】 胰腺癌的化疗效果不理想主要原因与肿瘤细胞的多药耐药有关。胰腺癌细胞多药耐药产生的机制目前并未阐明，随着对多药耐药认识的不断深入，新的逆转剂已经产生。本文通过近5年文献资料的回顾复习，对胰腺癌耐药机制及其抑制剂的研究进展作一综述。
【关键词】 P-糖蛋白 ; 抑制剂; 多药耐药
肿瘤的治疗是目前的研究热点，化疗就是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，然而肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药(MDR)是肿瘤治疗的主要障碍，也是多数肿瘤患者预后不佳的主要原因。目前大量的研究表明，肿瘤细胞产生MDR的原因和机制非常复杂，其中多药耐药蛋白P-糖蛋白介导的多药耐药最主要也最具有代表性，P-糖蛋白抑制剂的研究也成为近几年的热点。
1 P-糖蛋白的结构
P -糖蛋白(P-lycoprotein，P-gp)是一种腺苷三磷酸酶(ATP酶)，是能量依赖的膜结合蛋白，属于三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运子[1]。它由1280 个氨基酸组成，由一条单链表达 。这条单链分为同源的相等长度的2个亚单位，每个亚单位包括六个跨膜 区和两个ATP结合区分开并由一个多肽区分隔，其连接器区域的二级结构对于P-gp的两个亚单位有足够的协调功能，这种协调功能有可能需要两个ATP结合部位的相互作用[2]。ATP结合区位于胞浆侧，即核苷酸结合折叠，核苷酸结合折叠位于细胞质，为运输底物通过细胞膜传递能量。每一个ATP结合区包含三部分： Walker A，B，and signature C 模体，walker A 模体中的高保守性的赖氨酸残基直接与ATP结合，WalkerB模体中的高保守性的天冬氨酸残基与Mg2+相结合，人类p-gp需Mg2+--ATP结合和水解功能才能成为药物转运器[3]。镁也许在稳定ATP结合位点中扮演重要角色。Signature C 模体可能以化学过渡态的相互作用的形式参与加速ATP水解，也可能参与了由于细胞膜整环的构象改变需要底物易位，所以Signature C 模体还可能参与了ATP水解的能量转导[4]。和 Walker A模体的ATP结合区限制ATP结合位点不同的是，许多底物结合部位能够被p-gp的整个跨膜区(transmembrane，TM)鉴别。主要的药物结合位点位于TM6 and TM12及其附近，除此之外，TM1，TM4，TM10，and TM11也有药物结合位点，TM1的氨基酸类化合物参与药物结合口的构成并在决定合适的底物大小中扮演重要角色，而TM 2 and 3的甘氨酸残基在决定底物特异性中起重要作用。两个亚基的TM2/ TM11 and TM5/TM8区的相似性提示这些区域在p-gp的细胞质侧封闭了药物结合口，这就为循环周期的构象变化提供了“链条”[4，18]。除此之外，TM区，细胞内环路甚至ATP结合区都有药物结合位点，p-gp的这两个TM区由6个长的α-螺旋段组成，每一个TM区的5个α单环呈假双倍对称联接，而第6个α单环打破了这种对称，这两个α单环位于分子的中心而且最靠近(假)对称轴因此看起来是联在一起的。P-gp 有氨基和羧基末端，最初一直都认为，ATP结合区的氨基末端有所有的ATP水解必需的残基而且与ATP结合区的羧基末端没有相互作用[7]，但是现在普遍认为：氨基和羧基末端ATP位点都能水解ATP，然而还没有证据显示ATP能同时被这两个位点水解[4]。这就为我们以后的进一步研究提供了思路。
2 P-糖蛋白的功能及其产生耐药的机制
P-gp介导的外向通量是一种复杂的，ATP依赖的，能产生渗透梯度的并且在渗透方面敏感的运输。药物外向通量的第一步是P-gp通过ATP结合和水解作用对药物的识别，主要的药物结合部位位于TM6，TM12，TM1，TM4，TM10和TM11及其附近，结合口的结构在决定P-gp适合的底物/药物大小及底物特异性中扮演重要角色[8]。这一过程释放的能量被用于底物通过中央孔流出细胞膜，大约0. 6～3的ATP分子用于水解每一个运输到细胞外的药物分子[5]，相反的，Sauna and Ambudkar[9]的研究表明，这两种ATP分子的水解被用于每一个底物分子的转运，一种用于底物转运，一种用于下一次催化性循环中所需的泵的构想变化。ADP从核苷酸结合部位的释放结束了第一次催化性循环，并且引发了构象变化，这种构象变化降低了底物和核苷酸的亲和力，第二次催化性循环的开始是通过另一个ATP分子的水解和能量释放使蛋白质适应其天然构象，随后的ADP释放结束了另一次催化性循环，并使P-gp回到最初的状态，再次结合底物和核苷酸开始下一次循环[10]。
P-gp的异物排出机制的研究已经很多，然而，底物相互作用的确切部位还没有很好的解决[11]，目前流行的模型包括孔模型，外转酶模型和疏水真空吸尘器模型[4]。在这些模型中，由于P-gp能识别嵌入质膜小叶内部的底物并能通过蛋白通道转运底物，疏水真空吸尘器模型得到了广泛的认可，其作用机制类似于“疏水真空吸尘器”是因为当药物进入质膜时被识别和排出[12]，“疏水”是因为目前发现的疏水的大多数P-gp底物有二维的环形系统并在生理pH值下传递正电荷，然而，不带电的，亲水的和拥有二维环形系统的其他物质例如秋水仙碱也能被排出，提示还有其他机制在起作用。跨膜电位和pH值的变化也可能在这一过程中起作用。Rosenberg等指出P-gp通过细胞内核苷酸结合区域结合核苷酸来实现构象的变化，由于底物易位的需要，在细胞膜整环中，Signature C 模体可能参与了ATP水解能量的转导以及产生构象的变化[13]。
孔模型存在一种贯穿整个细胞膜的跨膜区域的核苷酸结合的重组，这种重组方式开放了中央孔，并以某种方式允许疏水药物(或底物)直接通过脂质双分子层到达中央孔的转运蛋白[14]。然而，近来也有报道称，药物底物首先以弥散的方式通过脂质双分子层到达药物结合口，穿过由位于药物结合口任一端的TM段构成的“门”，然后通过中央孔的转运蛋白将底物排出细胞膜外[15]。另一种假说是P-gp实质上是一种外转酶，这种外转酶能够识别细胞膜内部的小叶上的药物并将其转运到外部的小叶(以这种方式弥散到细胞外)或者直接进入细胞外隙。当亲脂药物通过类脂膜时，P-gp阻断其通过，并将亲脂药物从内部的小叶“外转”到外部的小叶和特殊的细胞介质[16]。
3 P-糖蛋白抑制剂的研究进展
Tsuruo等在上世纪八十年代首次报道了MDR的药理学逆转，Tsuruo等认为，钙通道阻滞剂维拉帕米和钙调素拮抗剂三氟拉嗪极大地提高了长春新碱的抗增殖能力，并在多药耐药的鼠类白血病细胞系的体内和体外研究中产生一种增强的长春新碱的细胞堆积[17]，最初的观察显示，在各种细胞系和体内肿瘤模型中许多化合物表现出对MDR的抵抗性，随后，许多P-gp抑制剂如PSC-833，MS-209，XR9576和NSC73306相继被发现能与P-gp相互作用并逆转P-gp介导的抗药性。基于年代学的发展和对P-gp的特异性和(或)亲和力，将P-gp抑制剂的发展分为了三代[10，18]。
3. 1 第一代P-gp抑制剂 第一代P-gp抑制剂是药理学化合物，这类化合物原是用于其它适应症，但是这类化合物能够抑制P-gp。许多拥有不同结构和功能的，能抑制P-gp的因子已经被鉴定出来，这些因子包括钙通道阻滞剂如维拉帕米，免疫抑制剂如环孢素A，抗高血压药如利血平，奎尼丁，育亨宾和抗雌激素类药如他莫昔芬，托瑞米芬。长春新碱能抑制P-gp 95%的功能，这比已经通过模拟实验的蒽环类抗生素的作用更强[19]。由于抑制P-gp的功能需要很高的药物血清浓度，而高剂量的此类药物具有毒性，因此第一代化合物作用力较弱和非选择性，限制了此类药物的应用。而且，许多第一代化学感受器本身就是P-gp的底物，需要与其他底物竞争MDR泵才能流出，因此，要产生足够的细胞内浓度就需要这类化学感受器的高血清浓度。第一代P-gp抑制剂的临床实验之所以失败就归因于上述原因，因此，研究人员把目光转向能直接明确抑制P-gp的第二代和第三代抑制剂[20]。
3. 2 第二代P-gp抑制剂 构成第二代P-gp抑制剂的因子缺乏第一代化合物的药理学活性但是拥有更高的P-gp亲和力。属于此类的因子包括PSC 833，右维拉帕米，比立考达(VX-710)，GF120918和MS-209 [10，20]。虽然这些化合物具有低毒性的优点，但是仍然具有限制其临床应用的特性，在体内可耐受剂量下，第二代P-gp抑制剂的亲和力太低而不足以产生明显的抑制作用，大多数第二代化学感受器也是CYP 3A4的底物，因此，抗肿瘤因子和影响CYP 3A4活性的MDR调节剂之间的竞争将会对药物代谢动力学造成不可预知的干扰，影响新陈代谢和清除机制。抗肿瘤药物的浓度的增加将导致很强的副作用，迫使剂量降到中毒标准以下[21]。此外，这些化合物对非靶点转运蛋白的抑制也会增强抗肿瘤药物的不良反应[22]。
3. 3 第三代P-gp抑制剂 构效关系和组织化学的方法促进了第三代P-gp抑制剂的发展，最初的目的是为了提高多药耐药肿瘤的治疗效果和抑制P-gp的高度特异性和毒性。第三代P-gp抑制剂既不是由CYP 3A4引起代谢，也不会改变抗肿瘤药物的血浆药代动力学。第三代P-gp抑制剂如LY335979，OC144093和XR9576经鉴定是具有较强作用力和高选择性的P-gp抑制剂，其作用力是第一代和第二代P-gp抑制剂的10倍以上[10，18]，临床上也没发现第三代P-gp抑制剂能引起其他抗肿瘤药物的药代动力学的变化，因此，这种从各种药物逐渐发展起来的化合物使癌症治疗得到了极大地发展，目前正应用在已使用不同的抗肿瘤药物的几种不同类型的癌症身上进行临床实验[23]，Tariquidar将此类药物应用于已使用紫杉酚和长春瑞滨的卵巢癌患者，第一和第二阶段的研究已经成功，第三阶段的实验已经开始，R101933和ONT-093经过试验表明能抑制P-gp泵，并对多西紫杉醇和紫杉酚的药代动力学没有影响，Eli Lilly公司开发的药物LY335979能竞争性抑制长春碱和P-gp的结合，由Glaxosmithkline公司开发的GF-120918能抑制P-gp和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，并与多柔比星没有药代动力学的相互作用。临床实验显示第三代P-gp抑制剂能增加有P-gp表达的肿瘤细胞中的其他抗肿瘤药物的细胞内浓度，第三代P-gp抑制剂的进一步研究的目标是癌症患者的长期存活率。然而，第三代P-gp抑制剂的第三阶段试验并没有成功，在P-gp抑制和提高生存率方面并没有获得显著的成效[22，23]。
近年来出现一类新的P-gp抑制剂，是一种制药辅药和以草本类作为补充的混合物[10，24]，其作为制药辅药的成分能对P-gp底物产生作用并提高生物可利用率，从成分的角度看，这些“惰性的”制药辅药的成分是一种很好的选择，但是由于这些成分能改变药物在体内的分布并造成严重的副反应，因此有很大的局限性。
另一类引起广泛关注的P-gp抑制剂是草本类成分，由于其无毒性和自身没有药理学活性，因此被作为理想的P-gp抑制剂。在一段连续的较长的历史时间里草药被大量的应用于日常饮食中，其安全性得到了肯定，由于草药成分能增强生物可利用率，提高组织穿透力(如血脑屏障)，减少胆汁排泄，因此被认为是理想的MDR抑制因子，这类P-gp抑制剂将会成为以后研究的热点，并在逆转多药耐药中发挥重要的作用。
4 小结和展望
本文综述了P-gp的结构，功能，产生耐药的机制及P-糖蛋白抑制剂的研究进展，由于P-gp结构的特殊性，其功能和产生耐药的机制十分复杂，尚待进一步研究，以逆转肿瘤MDR的临床试验结果尚不理想，多种方法的联合应用是今后逆转肿瘤MDR的研究热点 。解决MDR的根本途径还在于全面深入地研究和阐明MDR产生的机制，以寻求从根本上逆转MDR的对策。随着对P-gP抑制剂作用机制研究的不断深入。检测及逆转方法的不断改进，具有巨大潜能的P-gp抑制剂将在该领域发挥愈来愈大的作用。
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