【关键词】 结核分枝杆菌 ; 基因;突变 ; 耐药性
结核病是严重危害人民身体健康的传染性疾病。耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌(MDR-TB)的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药是结核杆菌产生耐药的分子基础。目前对结核杆菌耐药机制的研究主要集中在药物作用靶位及相关基因的突变上。现就结核杆菌对主要的抗结核药物的耐药机制的研究进展做一综述。
1 异烟肼(INH)
有研究表明，结核杆菌耐INH涉及多个基因变化：katG，inhA，kasA，ndh及oxyR-ahpC基因连接区。
1. 1 katG基因 即过氧化氢酶一过氧化物酶(catalase-peoxidase)的编码基因。异烟肼被结核杆菌内的过氧化氢酶-过氧化物酶活化，活化产物作用于enoyl-ACP还原酶(属于脂酸合成酶II系统，可促进短链脂肪酸合成脂酸)，抑制杆菌酸和细胞壁生物合成。katG基因的上游相隔44个碱基与furA基因(一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katG基因的启动子，并调控其表达)相连，下游相隔2794个碱基与embC基因相连，全长2223个核苷酸。引起INH耐药性的主要原因是katG基因的点突变、缺失、插入，完全缺失仅占INH耐药菌株的7%～24%。katG基因常见的点突变是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突变通常会造成过氧化氢一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐药[1]。Coll等[2]对6l株异烟肼耐药株进行分析，其中55%分离株检测到katG基因突变，最常见的变异是第315位密码子(占32%)，这些菌株显示了高水平的耐药。此外还可见katG基因104、108、138、148位等突变。各基因序列改变的具体位点与katG酶的活性以及INH耐药性的关系还有待进一步的研究。
1. 2 inhA基因 即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的enoyl-ACP还原酶的编码基因。活化的INH(异烟碱酰基)与inhA酶(enoyl-ACP还原酶)活性部位的辅因子NAD结合，生成高亲和力的共价化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP还原酶的亲和力，干扰了脂酸的合成，进而发挥抗菌作用。inhA基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%-35%[4] 。耐药的发生可由于inhA结构基因突变造成INH与NADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的C→T的点突变[3]以及inhA调节序列突变可能创造一个强有力的启动，使inhA蛋白过度表达从而提高对INH活性形式所需的浓度，引起对INH耐药[5]。inhA基因的突变伴随低水平INH耐药性，和katG基因不同，katG突变后耐药水平的高低取决于突变对过氧化氢一过氧化物酶活性的影响，突变导致酶活性完全丧失可引起高度INH耐药。InhA的突变不仅引起INH耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟(ETH)的耐药性[6]。
1. 3 oxyR-ahpC oxyR基因表达的蛋白是氧压的感应器又是基因转录的活化剂，参与调节katG和ahpC基因(编码烷基过氧化氢还原酶，参与氧化-应激应答[7])的表达。而结核杆菌的oxyR基因发生大量移码突变和缺失，没有活性，当Deretic[8]等用突变体与携带具有活性的oxyR-ahpC基因的质粒组成一个重组体，结果对异烟肼耐药，因此MTB对INH敏感可能是由于oxyR基因的异常化。同时Dhandayuthapani[9]等发现部分katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子(存在于oxyR-ahpC区)突变，增强ahpC表达来补偿过氧化氢酶一过氧化物酶的缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。因此可将ahpC突变作为katG基因变异的标志，但二者不是一种简单直接的因果关系[10]。
1. 4 kasA和ndh kasA基因编码β-酮酰基载体蛋白合成酶，参与分枝菌酸生物合成，是INH耐药的另一个相关基因，全长1251bp，编码471个氨基酸，其中最常见的突变是第312位点。但在大约19%敏感株中也发现同样突变，推断该基因在异烟肼耐药中表现为多态性[11]。katG、inhA、ahpC、oxyR和kasA基因突变并不能解释所有的异烟肼耐药问题。lee[12]等报道了一个与结核杆菌对异烟肼耐药有关的基因ndh，即编码NADH脱氢酶基因，ndh基因的突变使NADH脱氢酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制INH的过氧化，也阻止异烟酰乙酸NADH 与InhA酶的结合，从而使细菌产生耐药性，具体机制还有待进一步研究。
2 利福平
利福平作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基β亚单位，从而抑制mRNA的转录。rpoB基因是结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因，全长3543个碱基.当其中长81个碱基的核心区域-- 耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。在结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基β亚单位氨基酸序列中有3个短区域与耐利福平相关：507aa-534aa、567aa-574aa、687aa[13]。95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在507～533位的27个氨基酸(81bp)组成的区域，这一突变区被称为利福平耐药决定区(rifampicin resistance determing region，RRDR)。其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG的和编码526位氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见，因此这个区域的突变可作为一种检测结核杆菌耐RFP简易、快速的方法。在临床分离的MDR-MTB中，86%的耐药株有rpoB基因的突变，因此认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。
已知RFP耐药菌的rpoB基因有14种突变，其中9种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药。531、526位点突变株对所有利福霉素类药物均高度耐药。
3 氨基糖苷类
氨基糖苷类主要作用于结核杆菌的核糖体，抑制蛋白质合成。耐链霉素(SM)的结核杆菌，其编码核糖体16 SrRNA的rrs基因与编码核糖体蛋白S12的rpsL基因发生突变，降低药物结合到核糖体上的能力，使之对SM耐药[14]。rpsL基因突变是链霉素耐药的主要机制，编码第43位氨基酸的碱基 A→G的突变，是最常见的突变位点[15]。rrs基因突变点为512、513位的碱基插入，这些位置的碱基发生突变可导致高水平的耐药，rrs基因突变主要集中于530环区和915区，此两区均为16SrRNA和S12蛋白结合并相互作用的场所。耐丁胺卡那(AK)和卡那霉素的结核杆菌中，rrS基因突变率为67. 4%，最常见的突变是1401位点A→G单碱基置换(60. 5%)，少数分离株为(1402位)C→T或A、(1484位)G→T，这些突变主要发生于高水平耐药株，32. 6%的耐卡那霉素分离株未发现rrS基因突变，可能还存在其他耐药机制。卷曲霉素(CPM)和紫霉素(VIO)在结构上相似，结核杆菌对CPM和VIO耐药是由于tlyA基因(编码rRNA修饰酶2’-O -甲基转移酶)和rrS基因突变所致，其中 tlyA基因突变是耐药性产生的重要原因。卷曲霉素、紫霉素、卡那霉素和AK之间存在交叉耐药性[16]。
4 吡嗪酰胺
吡嗪酰胺(PZA)在细胞内酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而起杀菌作用。编码吡嗪酰胺酶的pncA基因突变致使酶活性丢失是其主要的耐药机制。pncA基因全长561bp，其突变分布在启动子区域和结构基因的各个位置。Hou等报道耐药结核菌的pncA基因有54位、118位、368位、501位的点突变，起始密码有一8bp丢失，88位ser→终止密码子等突变，而Park等报道在起始密码子一11上游区A与G点突变是最常见的类型，Endoh等[17]报道在382位有一8bp丢失，另见29位、11位突变。还有一些在102位发现无义突变(C→G)。但在敏感菌株中也发现了一些pncA基因突变，如第6位G和第300位CT的沉寂突变[18]。pncA基因突变的特点不一，是否与地理区域有关，尚需进一步探讨。另28%的PZA耐药菌的耐药机制仍在研究中，如吡嗪酸在菌体的转移等[19]。
5 乙胺丁醇(EMB)
EMB主要作用于阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸一阿拉伯半乳聚糖一肽聚糖复合物的形成。当阿拉伯糖基转移酶编码基因(emb)的操纵子突变致氨基酸替换，可改变药物与酶的相互作用而导致耐药。该操纵子由embA、embB和embC三个基因组成，其中embB基因，编码一个糖基转移酶，embB基因突变导致糖基转移酶结构改变，影响了EMB和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第306位密码子的错义突变最为常见[20]，该位点密码子突变具有相当的普遍性，可用于快速测定耐乙胺丁醇菌株。embC基因394位密码子和738位密码子的突变、embA中462位密码子、913位密码子等以及位于embC-embA之间的区域内的第1位、l2位和l6位密码子的突变均被检测到，但这些突变与耐药性之间的确切关系还要做进一步研究 [21]。
6 氟喹诺酮类药
氟喹诺酮类药物(FQ)是复治病例主要的抗结核药物之一，其作用靶位是结核杆菌的DNA旋转酶，DNA旋转酶由gyrA和gyrB两种基因编码的两个A亚单位和两个B亚单位组成。FQ主要作用gyrA基因编码的A亚基，可以抑制细菌染色体的DNA复制，而编码的gyrA基因发生突变则导致药物结合位点构象改变，以致产生耐药性。喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在gyrA基因保守区67～106位的密码子区，常见有94位GAC→GCC或CAC或TAC，90位GCC→GTG的突变[22]。gyrA基因突变与药物浓度和结构有关，gyrB基因突变可能改变了胞内药物的蓄积，而呈现低度耐药。
7 大环内酯类药物
大环内酯类药物作用于50S核蛋白体亚单位上，抑制细菌蛋白合成及核肽链的延伸而发挥抗菌作用。耐药结核杆菌染色体存在erm基因，其编码产生的酶能将核蛋白体亚基的23SrRNA上一个特异性腺嘌呤残基N6位甲基化，改变了核糖体构象，降低了细菌与大环内酯类的亲和力[23]。
结核分枝杆菌H37Rv的Tap基因(Rv1258)编码结核分枝杆菌的膜外排泵，约有12个跨膜区域和不同的基序特征，可能与大环内酯类抗生素耐药机制相关。
8 乙硫异烟胺及环丝氨酸
乙硫异烟胺可在结核杆菌内诱导产生4一烟醇产物，能抑制合成结核菌酸必需的结核菌酸合成酶。现已证实结核分枝杆菌基因ethA和ethR与乙硫异烟胺耐药有关：ethA编码的蛋白属于含黄素单氧化酶家族，催化激活乙硫异烟胺;ethR基因编码的阻抑物属于转录调节器TetR/CamR家族.负性调节ethA的表达[24]。inhA基因突变也可引起乙硫异烟胺耐受。
环丝氨酸(cycloserine)可通过抑制丙氨酸消旋酶(Al)及合成酶(Dd1)，抑制细菌细胞壁粘肽(肽聚糖)的合成，致结核分枝杆菌细胞壁缺损，减弱其耐酸能力，有杀菌和抑菌作用。谷氨酸脱羧酶基因(glutamate decarboxylase，gadA)和D一丙氨酸消旋酶(D-alanine racemase，alrA)基因的突变，也会影响细菌对环丝氨酸的敏感性[25]，具体作用机制有待进一步研究。
综上所述，结核菌对某种药物产生耐药性时，可能有多个基因介入，而一个基因的突变也可能影响到好几种药物的耐药性，由此说明了耐药基因的交叉性和互联性。因此积极开展耐多药结核病耐药机制的研究，积极开展抗结核新药的研制，加强结核病患者的治疗和管理，对控制耐多药结核病极有意义。
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