【摘要】 目的 研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法 取人肾小管上皮细胞株进行体外培养，分别向培养液中加入激活素A或激活素A+卵泡抑素，应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白(TGF-β)的表达，以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果 与对照组和卵泡抑素组相比，激活素组肾小管上皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多。结论 激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化，提示激活素A可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。
【关键词】 激活素A; 卵泡抑素;肾小管上皮细胞;转化生长因子β蛋白
Abstract Objective To study the stimulating effect of activin A on the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells cultured in vitro.Methods Renal tubule epithelial cell strains were cultured in vitro; activin A or activin A plus follistatin were added into the culture solution and immunohisochemical method was applied in detecting the expression of transforming growth factorβ(TGF-β) protein in the cultured cells and the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells was observed. Result The TGF-βprotein expressed by renal tubule epithelial cells in activin A group increased much more than that in control group or in follistatin group.Conclusions Activin A can promote the proliferation and transdifferentiation of renal tubule cells， which suggests that activin A may play an important role in interstitial fibrosis of renal tubule.
KEYWORDS activin A follistatin renal tubule epithelial cells TGF-βprotein
激活素A(activin，ACT)是由性腺分泌的肽类激素，是近年来发现的重要细胞因子，具有广泛的生物学活性[1]。ACT分泌病理性地增高或降低，可以导致组织细胞分化、增生、代谢异常[2-3]。卵泡抑素(follistatin，FS) 也是由性腺分泌的糖蛋白激素，可阻断ACT 的生物学效应。ACT和FS形成体内一对天然的拮抗体，共同调节组织细胞的分化，同样，其在肾脏细胞的分化中也具有显著调控作用。故本实验观察ACT对人肾小管上皮细胞增殖、转分化的影响，探讨ACT在肾小管纤维化中的作用，为阐明肾组织纤维化的发病机制，探讨防治方法提供新的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人近端肾小管上皮细胞株(HK2，购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)。
1.1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基(DF，Hyclone公司)，重组人激活素A(ACT-A)、卵泡抑素(FS)，(美国Peprotech公司)，胎牛血清(FCS，Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，小鼠抗转化生长因子β蛋白单抗工作液(TGF-β)、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及传代 取HK2细胞株，加入含15%FCS的DF培养基，吹打后以105/ml的细胞含量接种于细胞培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养，3天后换液。倒置显微镜观察，待细胞融合生长为单层后，0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA1:1混合后消化、1：2传代，传至3～5代取细胞行各指标检测。
1.2.2 细胞增殖检测 消化指数生长期HK2细胞，调细胞密度为1×104/ml，接种于96孔平底培养板上，37℃、5% CO2条件下培养48h，无血清FD培养液洗涤2次，加入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的ACT培养液(A组) ，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的FS培养液(F组)，30ng/mlACT+不同浓度(0.3～100 ng/ml)FS培养液(A+F组)，含无血清培养基的空白对照组(C组)再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4 孔。分别于培养结束前4h加入MTT(5mg/ml)20μl/，第48h结束培养。弃上清，加入DMSO150μl /孔，振荡10min。在酶标光度计上测光吸收值，测定波长为490nm，所得光吸收值代表相应孔细胞的相对数量。
1.2.3 免疫组化检测TGF-β 将指数生长期细胞消化后以1×104/ml /孔接种到24 孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养24h，无血清FD培养液洗涤2次，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的ACT培养液(A组) ，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的FS培养液(F组) ，30ng/mlACT+不同浓度(0.3～100 ng/ml)FS培养液(A+F组)，含无血清培养基的空白对照组(C组)，再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4孔。取片，冲洗，固定，冲洗，双氧水和羊血清封闭，TGF-β单抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜，冲洗3次，再加入二抗，37℃水浴1小时，进行DAB法染色，以细胞浆出现棕黄色并高出背景，胞核呈浅蓝色的为阳性染色，采用Leica-Qwin图象分析系统测定每张片上的阳性单位灰度值，灰度值越高说明目标物质表达越少。
1.3 统计学处理 数据应用SPSS10.0统计软件进行分析，P &< 0.05为有显著性差异。
2 结 果
2.1 ACT-A 对肾小管上皮细胞生长的影响 ACT-A对肾小管上皮细胞生长有明显的促进作用，在30ng/ml以内，呈剂量依赖性，当其浓度达100ng/ml时，促进小管上皮细胞增生的作用反而减弱(P&<0.01);单独给FS对肾小管上皮细胞增生无明显影响(P&>0.05);但FS能拮抗ACT对肾小管上皮细胞生长的促进作用，也呈剂量依赖性(P&<0.01)见表1。表1 不同浓度ACT和FS对肾小管上皮细胞生长的影响注： *与0ng/ml比较，P&<0.01; #与ACT组比较，P&<0.01
2.2 免疫组化结果 免疫组化染色片采用图像分析阳性染色灰度值结果显示：ACT显著促进肾小管上皮细胞表达TGF-β，并呈剂量依赖关系(P&<0.01);FS对肾小管上皮细胞分泌TGF-β无明显影响(P&>0.05);但FS能拮抗ACT促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β的作用，也呈剂量依赖性(P&<0.01)，见表2。表2 免疫组化TGF-β图像分析光密度值注： *与0ng/ml比较，P&<0.01; #与ACT组比较，P&<0.01
3 讨 论
肾小管上皮细胞转分化是肾小管间质纤维化形成的重要原因，而TGF-β被公认为致纤维化的重要因子，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志蛋白。ACT是新发现的TGF-β超家族成员，研究证明正常成人肾脏中几乎没有ACT的表达，但其天然拮抗物FS的表达却非常丰富，在急性缺血再灌注损伤的肾组织中ACT的表达显著上调，而FS表达明显下降[4]。这些资料提示，ACT可能在肾组织纤维化的发生发展机制中也起有重要作用。
本实验向体外培养的人肾小管上皮细胞培养液中加入外源性的ACT，结果发现ACT 在(0.3-100)ng/ml范围内呈剂量依赖性地刺激肾小管上皮细胞增殖，说明ACT对小管上皮细胞的刺激增生作用有一定的适应浓度范围。我们的试验还发现，ACT以剂量依赖方式促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β，TGF-β的表达，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志，说明ACT能刺激肾小管上皮细胞转分化，而肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞是其大量分泌细胞外基质，导致肾组织纤维化的始动环节。因此，研究结果说明ACT在肾组织纤维化的发生发展中起重要作用。
已经明确FS能与ACT不可逆地高亲和力结合，从而阻断ACT的作用。本实验利用FS能中和ACT的特性，向小管上皮细胞培养体系中加入FS，结果表明，单纯加入FS，对肾小管上皮细胞的增殖及其表达TGF-β无明显影响，但与ACT同时存在时，能显著抑制ACT对小管上皮细胞刺激增殖和表达TGF-β的作用，说明FS能抑制ACT介导的肾小管上皮细胞转分化，可能有防治肾组织纤维化的潜能。
参考文献
[1] Massague J.How cells read TGF-β signals[J].Nat Rev Mol Cell Biol.2000，1(3):169–178.
[2] Massague J，Blain SW，Lo RS.TGF-β signaling in growth control，cancer，and heritable disorders[J].Cell.2000，103(2)：295–309.
[3] Chen YG，Lui，HM，Lin，SL，et al.Regulation of cell proliferation，apoptosis，and carcinogenesis by activin.Exp[J].Biol.Med.2002，227(2)：75–87.
[4] Maeshima A，Zhang YQ，Nojima Y，et al.Involvement of the Activin-Follistatin System in Tubular Regeneration after Renal Ischemia in Rats.J[J].Am.Soc.Nephrol.2001，12(8):1685-1695.