银杏制剂对肺纤维化的干预作用及可能机制

【摘要】 目的 探讨转化生长因子(TGFβ1)在肺纤维化形成过程中的作用及银杏制剂干预肺纤维化的可能机制。方法 四组大鼠除正常对照组外，其余均一次性气管内注射BLM复制肺纤维化模型，两预防组于模型制备2小时后分别予以高剂量、低剂量银杏制剂每天灌胃治疗，于28天后处死动物，测定血清羟脯氨酸(HYP)含量；肺组织肺泡炎及肺纤维化程度；检测肺组织中TGFβ1的表达。结果 肺纤维化模型组与对照组比较，28天时血清HYP含量、TGFβ1蛋白的表达显著增多（P&< 0.01）；肺泡炎、肺纤维化程度显著增加（P&<0.01）。两银杏制剂预防组与模型组相比，28天时血清羟脯氨酸含量、TGFβ1蛋白的表达显著减少（P&<0.01）；肺泡炎、肺纤维化程度显著减轻（P&<0.05）。结论 TGFβ1参与了肺纤维化的发病过程；银杏制剂对博莱霉素所致肺纤维化有一定的预防作用，其作用机制可能通过下调TGFβ1的表达，抑制细胞外基质的沉积，从而阻断肺纤维化的发生发展。

【关键词】 银杏制剂; 肺纤维化; 博莱霉素

　　Abstract Objective To discuss the effect of transforming growth factor β1 (TGFβ1) in the formative process of pulmonary fibrosis and the possible intervention mechanism of gingko biloba extract.Methods 4 groups of rats were involved in the experiment: control group，high-dose intervention group，low-dose intervention group and model group; except the control group，the other 3 groups received one single intratracheal injection of bleomycin to establish the pulmonary fibrosis models; 2 hours later，the 2 intervention groups started to have the intragastric administration of high dose and low dose of gingko biloba extract respectively everyday; 28 days later，all the rats were killed in the 4 groups，and the content of hydroxyproline (HYP) in serum，the alveolitis，pulmonary fibrosis degree and the expression of TGFβ1 in pulmonary tissue were detected.Result The content of HYP in serum and the expression of TGFβ1 in model group increased much more than those in control group (P＜0.01) as well as the severity of alveolitis and the pulmonary fibrosis degree (P＜0.01); the content of HYP in serum and the expression of TGFβ1 in the 2 intervention groups decreases much more than those in control group (P＜0.01) as well as the severity of alveolitis and the pulmonary fibrosis degree (P＜0.01).Conclusions TGFβ1 is involved in the process of pulmonary fibrosis; gingko biloba extract is of certain prevention effect on pulmonary fibrosis induced by bleomycin，the mechanism may be its inhibiting effect on extracellular matrix deposit by down-regulating the expression of TGFβ1 so as to block the process of pulmonary fibrosis.

　　KEYWORDS gingko biloba extract　pulmonary fibrosis bleomycin

　　肺纤维化是弥漫性肺间质病变的最后结局。迄今尚无较理想的防治方法。结缔组织生长因子( connective tissue growth factor， CTGF)是促纤维化的细胞因子［1］ 。如何阻止肺纤维增生初期CTGF的生成是目前亟待解决的问题。 银杏制剂由银杏叶提取，主要成分为银杏内酯和黄酮甙组成。有研究表明［2-4］，银杏制剂能有效降低TGFβ1mRNA的表达，从而阻断细胞内依赖CTGF存在的信号转导途径，最终干预了内基质成分的过度生成。故本实验通过用博莱霉素制备大鼠肺纤维化模型，探讨TGFβ1在肺纤维化形成过程中的作用及银杏制剂干预肺纤维化的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠48只，体重180～220g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 药品及试剂

　　(1)注射用盐酸博莱霉素（bleomycin，BLM）由日本化药株式会社生产，批号Y32480；(2)银杏制剂，贵阳兴邦制药厂提供；(3)羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)试剂盒，购自武汉博士德生物制品公司；(4)抗TGFβ1（为兔抗鼠抗体）抗体及SABC（链酶亲和素-生物素-酶复合物，StreptAvidinBiotin Complex）试剂盒购自武汉博士德生物制品公司。

　　1.1.3 主要仪器

　　721型分光光度计：上海第三分析仪器厂；Olympus BX41显微图像采集系统：日本Olympus公司；Biomias图像分析仪：四川大学图像图形研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组

　　SD大鼠48只，随机分成正常对照组、肺纤维化模型组、银杏制剂高剂量预防组、银杏制剂低剂量预防组四组，每组12只。

　　1.2.2 模型制备

　　肺纤维化模型组经气管内注入博莱霉素5mg/kg，随后迅速将大鼠直立旋转，使药物在肺内分布均匀，制成肺纤维化模型，每日1ml生理盐水灌胃；银杏制剂高剂量预防组和丹芍化纤低剂量预防组模型制备同肺纤维化模型组，模型制备2小时后，分别经胃管内注入银杏制剂0.6g/kg、0.3g/kg (相当于成人剂量的10倍、5倍)，每日一次；正常对照组气管内注入同等剂量生理盐水。均每日正常喂食。在模型制备及灌胃过程中均无大鼠死亡。于28天时股动脉放血处死动物，收集标本。

　　1.2.3 检测指标及方法

　　1.2.3.1 肺组织病理学检查

　　各组大鼠均取左肺，用10%的中性福尔马林经左主支气管灌注固定30分钟后，投入10%的中性福尔马林中固定。在左肺下部矢状切面上取厚3～5mm的组织进行石蜡包埋，作5μm的石蜡切片，经苏木精-伊红（hematoxylineosin， HE）染色，按Szapiel等方法评价肺泡炎及肺纤维化程度，进行病理半定量分析。

　　1.2.3.2 血清HYP含量的测定

　　按说明书步骤进行。用公式计算血清羟脯氨酸的含量。

　　1.2.3.3 TGFβ1蛋白表达的测定

　　采用链霉亲和素-过氧化物酶法（SABC法）行免疫组织化学染色，工作浓度为1∶30。严格按试剂盒步骤进行。显微镜下观察胞浆呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，用PBS代替一抗作空白对照，结果为阴性。每张切片随机选取5个高倍镜视野（400倍），计算各组显微镜下高倍镜视野的阳性细胞表达百分比。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS11.5软件系统进行数据分析，计量资料以±s表示，4组间比较行方差分析，组间两两比较采用q检验，以P&<0.05为差异有显著性的标准；计数资料（肺泡炎及肺纤维化程度）采用Ridit分析进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 病理变化

　　对照组大鼠肺组织在28天时无明显病变。肺纤维化模型组部分肺泡腔及肺间隔可见炎症细胞浸润，肺泡结构破坏，部分肺泡腔缩小或肺泡腔消失，部分肺泡融合呈囊状扩张，肺泡间隔增宽，肺间质见大量成纤维细胞和纤维条索形成，并有新生血管的形成。与模型组相比，银杏制剂高低剂量预防组大鼠肺组织结构改善明显，肺间质仅见少量炎症细胞浸润，胶原纤维和成纤维细胞减少，肺泡间隔显著变薄、减少，肺泡炎及肺纤维化程度均显著减轻。其具体肺泡炎和肺纤维化程度分级，见表1。表1 各组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度分级（略）注：与对照组比较， **P&<0.01；与模型组比较△P&<0.05

　　2.2 血清HYP含量的变化

　　在肺纤维化形成过程中，28天时肺纤维化模型组血清HYP含量较对照组显著增高，差异有显著性(P&<0.01)，丹芍化纤高低剂量预防组较模型组显著减少(P&<0.01)，见表2。表2 各组大鼠血清HYP含量、肺组织TGFβ1蛋白表达的变化（略）注：与对照组比较， **P&<0.01；与模型组比较▲P&<0.01

　　2.3 TGFβ1蛋白表达的变化

　　经免疫组化SABC法检测TGFβ1示阳性细胞为胞浆内表达棕黄色或棕褐色颗粒者，在正常组大鼠肺组织内呈低水平分布，且染色为淡黄色；肺纤维化模型组大鼠肺组织TGFβ1主要表达在肺泡巨噬细胞，其次，支气管粘膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺间质内有一定量阳性细胞分布，百分比显著多于正常组（P&<0.01）；两银杏制剂预防组阳性细胞表达百分比较模型组显著减少（P&<0.01）。丹芍化纤高低剂量组TGFβ1的蛋白表达百分比没有明显差异性，见表2。
　　
　　3 讨论
　　
　　肺纤维化的发病机制尚未明确，治疗上有一定难度，目前还没有药物能有效控制肺纤维化的发展。银杏叶是传统中药，其提取物(Ginkgo bi2loba extract， GbE)的主要成分是黄酮类化合物和萜类化合物。临床用于治疗心脑血管疾病。实验显示， GbE 对肺纤维化和急性肺损伤均有防治作用［ 5，6 ］ 。
　　
　　本实验BLM致小鼠肺纤维化过程中，肺组织TGF－β表达均增多，肺病理出现明显的肺纤维化，这说明， 肺内TGF－β增多在肺纤维化形成中起重要作用。由此推测， GbE阻止肺内TGFβ异常增多，是GbE防治肺纤维化形成的机制之一。另有实验证明GbE能对抗感染和非感染因素引起的肺的氧化损伤，具有抗肺氧化损伤的作用［7］。
　　
　　本实验结果表明TGFβ1参与了肺纤维化的发病过程；银杏制剂对博莱霉素所致肺纤维化有一定的预防作用，其作用机制可能通过下调TGFβ1的表达，抑制细胞外基质的沉积，从而阻断肺纤维化的发生发展。证实银杏制剂能明显抵制肺纤维化的形成与发展。但其干预肺纤维化形成的分子机制需我们进一步探讨。

参考文献

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　　［2］韦小瑜，何云，程明亮. 细胞因子与肺纤维化［J］. 西南军医.2006， 8 (2) : 54～57.

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　　［5］张宏， 孟亚娟， 斯琴， 等. 银杏叶提取物对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的保护作用［J］. 基础医学和临床， 2002， 22 (2) : 155～158.

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　　［7］Chen XL， L iWB， Zhou AM， et al. Role of endogenous peroxynitrite in pulmonary injury and fibrosis induced by bleomycin A5 in rats［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003， 24(7) : 697～702.