圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响

　　　　 作者：田素燕 李连之 高 磊 穆建帅 刘晓燕 谭相石

【摘要】 采用远紫外圆二色光谱法系统地研究了细胞红蛋白(cytoglobin， Cygb)的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对细胞红蛋白二级结构的影响。结果表明: 当Cygb浓度&<1 μmol/L时，它主要以α螺旋形式存在，其α螺旋含量&>60%; 当Cygb浓度从0.3 μmol/L增大到2.0 μmol/L时，其α螺旋含量迅速降低;当Cygb浓度&>2.0 μmol/L时，其α螺旋含量随浓度的增大变化很小(约30%)。随着温度的升高，Cygb的α螺旋含量逐渐减小，但既使温度达到368 K，它仍保持有20%的α螺旋结构，说明该蛋白具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中，Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中，Cygb的α螺旋含量明显增加，这说明醇类可以诱导其α螺旋的生成。

【关键词】 细胞红蛋白， 圆二色光谱， 二级结构， α螺旋

　1 引 言

　　细胞红蛋白(cytoglobin， Cygb)是近期在脊椎动物组织中发现的第4种珠蛋白[1]，它具有典型珠蛋白的“threeoverthree”类型的α螺旋三明治折叠结构，但E螺旋中的His81却与血红素配位，形成与神经红蛋白(neuroglobin， Ngb)相似的六配位的血红素[2，3]。Cygb在人体各类组织中几乎都有表达，但其确切的生物功能目前还不完全清楚。研究表明，Cygb可能具有携氧、储氧、氧感受器以及过氧化物酶等功能，此外它也可能与胶原形成有关[4]。

　　目前，在Cygb的空间结构、携氧动力学特征和功能多样性等方面都有了一定的研究[1，4～7]，但对Cygb在溶液中的结构特性以及各种环境因素对其结构和构象的影响的研究甚少。研究蛋白质在溶液中的结构状态及结构变化对于了解其功能至关重要，圆二色光谱(CD)是研究溶液中蛋白质二级结构的一种强有力的实验方法[8～10]。本研究以远紫外圆二色光谱技术研究了细胞红蛋白的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对Cygb二级结构的影响，深入了解Cygb化学生物学的基本性质，为研究Cygb的生物功能及其在医药学的的应用提供有用的信息。

　　 2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　AKTA purifier 100快速蛋白纯化系统(瑞典Amersham Biosciences公司); J810 圆二色光谱仪(日本Jasco公司); HP8453 型紫外可见阵列二极管分光光度计(美国HewlettPackard公司)，pHS3D pH计(上海雷磁公司)。

　　带有人细胞红蛋白基因的pET3a质粒由德国 Johannes Gutenberg University of Mainz大学 Frank Gerlach 教授提供。E.Coli BL21(DE3)plys为本实验室保存，酵母提取物和胰化蛋白胨(英国Oxoid公司)，实验用水为二次去离子水，其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。

　　2.2 细胞红蛋白样品的制备

　　将带有细胞红蛋白基因的pET3a 质粒转入E.Coli BL21(DE3)plys 细菌中，按文献[11]方法进行发酵表达，收集菌体。此蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达，本研究以更接近天然态的可溶性形式表达的蛋白为研究对象。可溶性形式表达的蛋白依次经(NH4)2SO4分级沉淀，Q Sepharose F F阴离子交换柱，Hiload16/60 Superdex 75 凝胶过滤柱和CM Sepharose F F 阳离子交换柱纯化，得到电泳纯的细胞红蛋白。细胞红蛋白贮存液的浓度通过测定其在280 nm处的吸光度值(ε280=27.8 L/(mmol·cm)) 计算[12]得到。

　　2.3 圆二色光谱的测定

　　在5 mmol/L TrisHCl(pH 7.4)缓冲溶液中，蛋白终浓度依次为0.3， 0.9， 1.5， 2.0， 3.1， 3.9， 4.8， 5.3， 9.6和19.4 μmol/L时考察蛋白浓度对Cygb的CD谱的影响。在10 mmol/L TrisHCl (pH 7.4)缓冲溶液中，蛋白终浓度为1.5 μmol/L，每个测量温度(298.0～368.0 K)温育10 min，考察温度对Cygb的CD谱的影响。在10 mmol/L Tris 碱贮存液中，加HCl或NaOH溶液调节其pH值至所需范围(2.2～12.0)，用pHS3DpH计测量pH值，蛋白终浓度为4.5 μmol/L， 4 ℃放置12 h，考察不同pH溶液对Cygb的CD谱的影响。溶剂分别为水、100%甲醇、70%乙醇，蛋白终浓度为4.8 μmol/L， 4 ℃放置12 h，考察溶剂性质对Cygb的CD谱的影响。

　　在Jasco J810圆二色光谱仪上进行圆二色光谱测量，并配备恒温样品池支架和Julabo F12 恒温器，光源系统用氮气保护(流量为5 L/min)，除测量温度对Cygb的CD谱的影响实验采用10 mm光径样品池外，其它实验均采用1 mm光径样品池，光谱扫描时均扣除溶液空白的干扰，除测量温度对Cygb的CD谱的影响实验外，其它实验均在298 K下进行。测量参数：波长扫描范围250～190 nm，扫描速率100 nm/min，分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次。利用圆二色光谱仪附带的杨氏法二级结构分析软件对实验数据进行各种二级结构含量的估算[13]。 分 析 化 学第37卷第8期田素燕等：圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响

　　 3 结果与讨论

　　3.1 细胞红蛋白浓度的影响

　　图1是Cygb在5 mmol/L TrisHCl(pH 7.4)缓冲溶液中不同浓度下的圆二色光谱，内嵌图为Cygb α螺旋含量随蛋白浓度的变化曲线。由图1可见， 图1 不同浓度时细胞红蛋白的远紫外CD光谱，内嵌图为Cygb的α螺旋含量随蛋白浓度的变化曲线

　　Fig.1 FarUV CD spectra of cytoglobin(Cygb) at different concentrations， Insert: change in αhelix content as a function of cygb′s concentrationCygb在209和222 nm处有两个负峰，在193 nm处有一个正峰，这是典型的α螺旋结构特征峰。当Cygb浓度&<1 μmol/L时，蛋白中α螺旋含量最高可达70.2%。随着Cygb浓度增大，蛋白肽链的二级结构发生变化，当蛋白浓度达到2 μmol/L时，其α螺旋含量降至35%，降低的α螺旋几乎都转化为β折叠。但浓度继续增大时，结构不再变化，其α螺旋含量维持在30%左右，β折叠约为35%。虽然细胞红蛋白在人体各组织中广泛存在，但其在体内的含量仅在μmol/L级水平[5]，说明在生理条件下，Cygb主要以α螺旋形式存在。与Ngb相比，蛋白浓度对二级结构影响的变化趋势是一样的，但对于Ngb而言，其浓度效应不如Cygb敏感; 当Ngb浓度低于20 μmol/L时，其α螺旋含量&>60%;当Ngb浓度高于40 μmol/L时，其α螺旋含量降为30%[14]。这种浓度效应的影响可能与它们在体内的含量相关，Ngb是在神经组织中特异表达的蛋白，在视网膜中高达100 μmol/L[5]。

　　3.2 温度的影响

　　图2为Cygb在不同温度下的圆二色光谱，内嵌图为Cygb的α螺旋含量随温度的变化曲线。由图可以看出，低于330 K，Cygb的CD谱型没有明显的变化，其α螺旋含量变化不大。 图2 不同温度时细胞红蛋白的远紫外CD光谱， 内嵌图为Cygb的α螺旋含量随温度的变化曲线

　　Fig.2 FarUV CD spectra of Cygb at different temperature. Insert: change in αhelix content as a function of temperature 当温度继续升高时，193 nm处的峰值降低且不规则，209和222 nm处的峰值也降低，并且峰型平坦，其α螺旋含量由最初的40.2%降至21.4%。但即使温度达到368 K，Cygb仍保持有约20%的α螺旋。可见该蛋白在高温下仍有一定量的二级结构，这说明细胞红蛋白是一种高热稳定性蛋白[15]，但与神经红蛋白相比，其热稳定性稍低些[14]。这两种蛋白的高热稳定性可能是因为血红素的六配位结构更有利于维持蛋白质高级结构的稳定性。

　　3.3 溶液pH值的影响

　　图3为不同pH值下Cygb的圆二色光谱，内嵌图为Cygb的α螺旋含量随pH值的变化曲线。当pH值由7.0变至2.2时，Cygb在193， 209和222 nm处的峰值明显降低，其α螺旋含量由39.4%降至20.6%，β折叠含量则由35.3%增至43.9%;当pH值由7.0变至12.0时，Cygb在193， 209和222 nm处的峰值降低，但较酸性条件下变化小，其α螺旋含量由39.4%降至23.7%， β折叠含量由35.3%增至41.2%。总体而言，在不同pH值条件下Cygb的变化趋势与神经红蛋白的变化趋势是相同的，两者都在pH 7.0时α螺旋含量最高[14]。蛋白质分子中α螺旋和β折叠的稳定性主要取决于分子内部的氢键。当溶液为酸性或碱性时，溶液pH值的变化造成蛋白分子的内部氢键发生改变，使α螺旋等二级结构发生改变，从而对蛋白的二级结构造成不同程度的破坏[14]。

　3.4 溶剂性质的影响

　　图4为Cygb在不同溶剂中的圆二色光谱，表1为在不同溶剂中Cygb各二级结构的含量。在不同的溶剂中，Cygb的远紫外CD光谱的谱型变化较明显。 图4 不同溶剂中细胞红蛋白的远紫外CD光谱

　　Fig.4 FarUV CD spectra of Cygb at various solventsCygb在去离子水中的CD谱型与在TrisHCl缓冲液中的谱型相似，均在193 nm处有一个正峰，在209和222 nm处出现负峰。在100%甲醇中和在70%乙醇中，Cygb的CD谱型有一定的相似性，193 nm处的峰在甲醇中红移至194 nm，在乙醇中红移至196 nm， 209 nm处的峰位都红移至210 nm，峰值降低且变得平坦， 222 nm处的峰值也降低，但乙醇的影响大于甲醇。表1 不同溶剂中细胞红蛋白各种二级结构的含量 由表1可知，在去离子水、甲醇和乙醇中，4.8 μmol/L Cygb所含α螺旋含量分别为35.5%， 75.6%和75.9%。在去离子水中所含的β折叠在醇溶液中都转变为了α螺旋。醇类经常被视为诱导α螺旋生成的溶剂[16]，因为高浓度的醇会使蛋白质与溶剂间的氢键作用力减弱， 导致多肽链内部的氢键相对增强[17]， 从而可形成某些二级结构，这种作用可稳定蛋白结构，同时说明Cygb对醇类溶剂的高稳定性。4 结 论

　　综上所述，细胞红蛋白所处的环境对其二级结构的影响比较明显，环境的改变将引起该蛋白的二级结构的明显变化。浓度的增加、温度的升高、溶液酸碱性的变化和溶剂性质的改变均使Cygb二级结构中α螺旋含量不同程度的改变。蛋白质的结构和构象与其功能息息相关，详细了解Cygb二级结构的影响因素，对研究其生物功能具有重要意义。

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