荧光检测海水介质中的一氧化氮

　　　　 作者：刘春颖 赵敏 任春艳 ，杨桂朋 李培峰 韩洋

【摘要】 基于2，3二氨基萘(DAN)与一氧化氮(NO)在海水介质中生成荧光性2，3萘酚三唑(NAT)来测定海水中NO。确定了荧光法测定NO的条件(λex=383 nm，λem=410 nm)、温度和时间对DAN捕集NO的影响，以及DAN溶液对捕集NO的影响。测得NO浓度与其荧光强度之间呈线性关系，线性范围1.4～1400 nmol/L， r=0.9985，P&<0.0001;检出限1 nmol/L (S/N=3);相对标准偏差1.63%(14 nmol/L NO);不存在介质干扰。同样条件下与NaOH为介质的荧光法相比，本方法将检出限提高了1个数量级。结合吹扫捕集检测出青岛石老人(36°05′46″ N; 120°29′40″ E)海水中NO浓度为(0.12±0.01) nmol/L，可用于监测硝普钠在海水中释放NO的规律。关

【关键词】 一氧化氮， 海水， 荧光， 2，3二氨基萘

　　　　本文系国家自然科学基金 (Nos. 40706040，40376022)、山东省中青年科学家科研奖励基金(No. 2007BS08015)、山东省自然科学基金(No.Y2008E04)，国家杰出青年科学基金(No.40525017)和山东省科技发展计划(No.2006GG2205024)资助项目

　　1 引 言

　　一氧化氮(NO)是一种化学性质特殊但具有重要环境效应的自由基，它是导致臭氧层损耗的重要因素。自20世纪80年代，分子生物学的发展逐渐发现和证实了NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，在生命过程中起着重要作用。研究表明，NO对浮游植物的生长有一定的影响，它可能是浮游植物(藻类)生长的信息因子[1～3]; NO对海洋氮循环也会产生重要影响。已建立了一些检测海水中NO浓度的测定方法，开展了NO的生物地球化学研究[4～6]。然而，无论是采用Nafion或Co(salen)/Nafion修饰电极，还是商品化的NO微传感器，都不能真正实现现场测定海水中NO的浓度[4～6]。本研究在2，3二氨基萘(2，3Diaminonaphthalene， DAN)可以捕集NO 产生具有强荧光性的2，3萘酚三唑(2，3naphthotriazole， NAT)[7]基础上，建立了海水介质中直接测定NO的荧光法。并将此方法应用于现场测定海水中NO浓度和动态监测硝普钠在微藻培养体系内释放NO的过程。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　F4500荧光分光光度计(日本Hitachi公司);UV2550紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司);全自动电子分析天平(中国Sartorius公司)，精确度为0.1 mg;HPG280B 型光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);微量进样器(上海安亭微量进样器厂)。高纯NO气体(99.9%， 大连大特气体有限公司);高纯N2气体(99.999%，青岛合利工业气体中心);天然海水采自青岛近海，经0.45 μm醋酸纤维滤膜(上海医药工业研究院)过滤后使用;2，3二氨基萘(≥95%，GC)和二甲基甲酰胺(SigmaAldrich公司，美国);N亚硝基乙青霉胺(美国WPI公司);EDTA和硝普钠(SigmaAldrich公司);NaOH和NaNO3(青岛市化学试剂厂);Nah3PO3(连云港市化学试剂厂);NaSiO3(成都化学试剂厂);维生素B1、维生素H、维生素B12(广东汕头市光华化学厂);所用试剂均为分析纯;实验用水为MilliQ水。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 NO的标准溶液 在通风橱中，向2 mL水中通高纯氮气除氧30 min，再以每秒钟一个气泡的速度通入高纯NO气体30 min后溶液达到饱和，其浓度为1.4 mmol/L，此饱和溶液可稳定保存3 h[8]。

　　2.2.2 DAN 溶液配制 用二甲基甲酰胺配制10 mmol/L DAN储备液，避光于冰柜中(-21 ℃)保存。然后分别用水，10 mmol/L NaOH溶液和过滤海水配制成40 μmol/ L DAN测定液。分别用高纯氮气除氧30 min后避光冷冻保存，使用前移至冷藏。

　　2.2.3 确定荧光测定条件 对DAN捕集NO前后的溶液在紫外可见分光光度计上进行250～450 nm吸收光谱扫描，找出不受DAN影响的NAT吸收峰;以此为激发波长进行400～500 nm发射光谱扫描，找到测定NAT的最大发射波长;以此最大发射波长为激发波长进行350～400 nm激发光谱扫描。

　　3 结果与讨论

　　3.1 测定NO的荧光条件及其机理

　　对比海水介质中DAN捕集NO前后的吸收光谱(图1)可见，不受DAN影响的吸收峰在370和383 nm。分别以370和383 nm为激发波长，找到测定NAT的最大发射波长为410 nm;而以410 nm为发射波长时， 图1 海水介质中DAN捕集NO前后的吸收光谱

　　Fig.1 Absorption spectra of 2，3diaminona phthalene(DAN) in seawater before and after trapping NO 找到测定NAT的最大激发波长为383 nm，370 nm处未见峰(图2); λex=383 nm时监测λem=410 nm处的荧光强度具有较好的线性。分别对NaOH和海水介质中DAN和NO混合溶液做λex=383 nm时的发射光谱和λem=410 nm时的激发光谱扫描。结果表明，海水介质中生成的荧光物质与碱性条件下生成的荧光物质具有完全相同的发射和激发波峰位置。确定荧光测定条件为：λex=383 nm，λem=410 nm，扫描速度为2400 nm/min，响应时间0.5 s。由图3可见，DAN捕集NO只有在碱性条件下才有强荧光，而海水介质明显优于NaOH溶液。据文献[9，10]报道，DAN与NO结合只有在碱性条件下(pH 11～12)才能产生强荧光的NAT(图解1)，而且不受缓冲介质的影响。海水本身就是一个碱性缓冲体系(pH≈8.1)，所以无需加入碱液就能产生强荧光的NAT， 而且其荧光强度比碱性介质高。有利于降低荧光法测定NO的检出限。

　　3.2 温度和时间对DAN捕集NO的影响

　　在海水介质中分别进行了5，10，15，20和25 ℃下DAN捕集NO的反应，结果表明，温度对峰位置和荧光强度基本没有影响。分别进行了NO不同浓度(1.4 nmol/L～1.4 μmol/L)与40 μmol/L DAN结合时间的实验。结果发现，1.4 μmol/L NO与40 μmol/L DAN结合达到稳定需要15 min， 同样条件下，0.14 μmol/L NO需要5 min， 14 nmol/L NO需要2 min，1.4 nmol/L NO在瞬间即可达到稳定。结果表明，DAN捕集NO的时间受到NO浓度的影响，测定时必须给予充分的捕集时间。

　　无论在水相还是气相，NO都极易被氧化。用高纯氮气对10 mL 40 μmol/L DAN溶液进行除氧30 min，然后进行捕集1.4 μmol/L NO的实验，结果其荧光强度与相同条件下未除氧的差异在测量误差范围内。表明DAN溶液对NO的捕集可能绝大部分发生在NO被氧化之前。所以本研究中DAN溶液不必除氧，可以直接用于捕集NO。

　　对DAN溶液捕集NO的过程进行了明暗对比实验。结果发现，避光进行的捕集NO的实验荧光值很快达到了稳定，而在光照条件下荧光值很不稳定。其原因是DAN溶液会受到光照的影响，同时，海水介质中亚硝酸盐在光照下会分解产生NO[11]。所以本方法必须在避光条件下进行。

　　3.4 海水介质中荧光检测的线性范围、检出限、精密度和准确度

　　以λex=383 nm，λem=410 nm为测定条件，用微量进样器在10 mL DAN溶液加入不同浓度NO，体系的荧光光谱如图5所示。结果表明，本方法测量海水中NO的检出限为1 nmol/L(信噪比S/N=3);线性范围1.4～1400 nmol/L，线性回归方程为y=0.7274x+36.227(r=0.9985，P&<0.0001)。而在相同条件下，NaOH溶液中NO的检出限为14 nmol/L(S/N=3);线性范围14～1400 nmol/L，线性回归方程为y=0.4676x+9.5696， (r=0.9981， P&<0.0001)。因此，海水介质能降低荧光测定NO的检出限约1个数量级。

　　对海水介质中14 nmol/L NO和40 μmol/L DAN混合溶液进行荧光测定，平行测定11次，相对标准偏差为1.63%。用N亚硝基乙青霉胺(SNAP)化学计量分解释放NO，制备NO标准溶液[12]：将500 mL水调节pH 9. 0，溶解入5 mg EDTA，用高纯氮气除氧30 min后将11.0 mg SNAP加到混合液中。所得溶液避光冷藏在冰箱中待用。测定时将一定体积的SNAP溶液注入到海水中后进行荧光测定。结果表明，以NO饱和溶液和以SNAP分解法配制的NO标准溶液所得测定结果基本一致。

　　3.5 海水介质中荧光检测NO方法的应用

　　3.5.1 硝普钠在海水中释放NO 硝普钠(Sodium nitroprusside， SNP)是一种常见的NO供体，观测它在海水中释放NO的规律，有助于理解NO对海水体系中生物的作用及规律。取100 μmol/L SNP于2 mL DAN溶液中，每5 min连续测定DAN捕集NO后荧光强度的变化(即监测累计量)，可以看到NO浓度有随时间延长而增加的趋势(图5)，证明在观测时间内SNP可连续释放NO气体。在500 mL锥形瓶中加入培养微藻时的f/2配方溶液，加入100 μmol/L SNP后，把锥形瓶放入光照培养箱(温度22 ℃，光照强度4500 lx)，然后连续取样检测锥形瓶内NO浓度的变化，结果发现，100 μmol/L SNP在海水中可连续释放NO气体8 h，浓度维持在100～400 nmol/L(图6)。本实验重复了3次，规律基本一致。

　　3.5.2 对海洋生态系中NO浓度的检测 由于NO是一个疏水性的易扩散简单小分子，所以当流动的惰性气体通过待测样品时，它很容易随流动气体扩散出样品溶液，进而被导入DAN 测定液中。故采用吹扫捕集方法可以现场测定海水中NO浓度。2008年11月12日13：00在青岛近岸石老人(36°05′46″ N; 120°29′40″ E)采集多份水样，对现场海水(500 mL)用高纯氮气进行吹扫1 h，用10 mL 40 μmol/L DAN溶液捕集NO，采用上述荧光测定方法，检测出海水中NO浓度为(0.12 ± 0.01) nmol/L。 通过这种吹扫捕集的方法还可以监测海洋生物培养体系中NO浓度的变化。吹扫捕集前后同为海水介质，避免了介质不同对NO浓度测定的干扰。

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