分散液液微萃取柱前衍生高效液相色谱法测定水样中双酚

【摘要】 建立了分散液液微萃取柱前衍生高效液相色谱法测定水样中双酚A的分析方法。通过交互正交试验和混合型优化实验设计对影响因素(萃取剂体积、分散剂类型及其体积、水样体积、pH值及离子强度)进行了优化。优化后的分散液液微萃取条件为：60 μL萃取剂，0.4 mL分散剂(甲醇)，pH 4.0;优化后的柱前衍生化条件：0.1 mL 2.0 g/L衍生剂(对硝基苯甲酰氯)、衍生化时间30 min;方法的线性范围：0.002～0.2 mg/L(r=0.9997)，检出限0.007 μg/L(S/N=3);不同浓度双酚A的萃取率为59.0%～63.0%，相对标准偏差(RSD)2.5%～9.2%(n=5);水样中双酚A的加标率为86.5%～107.1%，RSD为4.0%～11.9%(n=5)，其它雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇和17α乙炔基雌二醇)对双酚A的测定无干扰。本方法可以对水环境中的痕量BPA进行检测，具有操作简便、快速等优点。

【关键词】 分散液液微萃取，柱前衍生，高效液相色谱，双酚A

　　 1 引 言

　　双酚A(Bisphenol A，BPA)是生产聚碳酸酯、环氧树脂的重要原料，可用于树脂和阻燃剂生产[1]。BPA属于“环境激素”，具有雌激素效应，ng/L～μg/L水平就会对人类和野生动物的健康带来威胁[2，3]。

　　BPA检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[4]、分子印迹法(MIPM)[5～7]、气相色谱质谱法(GCMS)[8]、酶联免疫吸附法(ELISA)[9]等。由于BPA在水环境中浓度较低[10]，常采用液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、液相微萃取(LPME)和固相微萃取(SPME)等预处理方法进行富集，其中SPME和LPME较为常用，具有消耗溶剂少或无需萃取剂、富集效果好、方便等优点，但也存在诸如SPME的萃取头价格昂贵、易碎，LPME平衡时间较长等不足[10，11]。Ahmadi等[12]发明的分散液液微萃取(DLLME)技术，因具有环境友好、操作简单等优点而被广泛应用于环境样品的萃取分离[13，14]。柱前荧光衍生可显著提高BPA荧光效率及检测灵敏度[15]，BPA衍生化测定方法已有报道[15，16]，但衍生化反应需在无水条件下进行，往往需要脱水和氮气缓慢吹扫、挥干等步骤。

　　本研究采用DLLME技术对水样中BPA进行萃取，对离心后得到的沉淀相(有机相)中的BPA进行衍生化反应，从而简化衍生化过程，最后利用HPLC分析衍生化样品中的BPA。本方法可于室温下进行，操作简便、快速。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1200型HPLC(美国Agilent公司)，配备Rheodyne 7725i手动进样器、真空脱气装置、二元泵、柱温箱及荧光检测器;TCC18色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm);DELTA320梅特勒托利多pH计;216PK冷冻离心机(德国Sigma公司)。

　　BPA、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及17α乙炔基雌二醇(EE2)均购自Sigma公司;[C6MIM][PF6](99%);丙酮、甲醇和乙腈为色谱纯;NaCl和NaOH为分析纯; 2.0 g/L对硝基苯甲酰氯(≥98.0%)乙腈溶液。200 mg/L BPA储备液，置于4 ℃冰箱中保存备用。实验用水由DirectQ3UV(法国Millipore公司)制备。

　　2.2 分散液液微萃取样品的制备

　　准确移取适量BPA(0.02 mg/L)使用液于10 mL锥形玻璃离心管内，用1 mL注射器将萃取剂([C6MIM][PF6])和分散剂(丙酮或甲醇)混合液快速注入到离心管内的BPA溶液中，形成混浊液，轻轻摇晃，以5000 r/min离心8 min，用50 μL进样针抽取沉淀相5 μL，进样。

　　2.3 分散液液微萃取样品的衍生化

　　准确移取分散液液微萃取样品的沉淀相10 μL于棕色样品瓶中，加入0.10 mL对硝基苯甲酰氯乙腈溶液，摇匀，于暗处放置30 min后，抽取上清液5 μL，进样。

　　2.4 色谱条件

　　流动相为甲醇和水，梯度洗脱：0～5 min，70%甲醇;5～10 min，85%甲醇;10～18 min为后运行时间。流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;荧光检测：λex=230 nm，λem=315 nm。

　　3 结果与讨论

　　3.1 分散液液微萃取条件优化

　　考察萃取剂体积(A)，水样体积(B)，分散剂类型(C)，pH值(D)，离子强度(E)，和分散剂体积(F)6个因素，选取的水平依次为A： 60， 90 μL; B： 3， 5 mL; C： 甲醇、丙酮; D: 4.0， 7.0，E: 0， 0.4 mol/kg; F: 0.4， 0.6 mL。

　　3.1.1 显著因素的筛选 选取L16(215)正交表进行分析，任意次序完成正交表中的16组实验，每组设两个平行及空白对照，以平行样BPA浓度的平均值与空白实验的差为指标值(Yi)，空白列用于估算实验误差，各影响因素的显著性见表1。从表1看出，对Yi影响显著的因素包括水样体积、萃取剂体积、分散剂类型以及水样体积与萃取剂体积的交互作用(A×B)。根据Yi变化趋势，分散剂类型确定为甲醇;A×B的作用小于因素A和B的单独作用，则进一步的实验着重优化因素A和B。不显著因素确定为pH 4.0、不调节离子强度及分散剂体积0.4 mL。表1 交互正交试验结果的方差分析

　　3.1.2 混合型优化实验 萃取剂体积(A)和水样体积(B)对Yi的效应相反，分别为正效应和负效应。实验表明，萃取剂体积50 μL和水样体积9 mL时，得到沉淀相小于2 μL，难以取样。为使Yi最大，同时又容易进行取样操作，A水平设50与60 μL，B设5， 6与7 mL。采用混合型21×31设计进行优化(图1)：确定水样体积(B)为7 mL;当萃取剂体积(A)为50 和 60 μL时，BPA萃取率(ER)约分别20%和50%，故确定萃取剂体积为60 μL。

　　3.1.3 实际水样中BPA的加标回收率 松花江某江段河水、实验室自来水及某排水沟水样中BPA经DLLME后的加标回收率(R)见表2。表2 水样中BPA分散液液微萃取后的加标回收率

　　3.2 方法的建立

　　3.2.1 方法的线性范围及检出限 利用优化后的DLLME条件萃取水样中的BPA，对离心后沉淀相中BPA进行衍生化反应，然后利用HPLC分析。方法的线性范围为0.002～0.2 mg/L，相关系数0.9997;检出限0.007 μg/L(S/N=3)。

　　3.2.2 方法的精密度与准确度 选取不同浓度BPA溶液，进行分散液液微萃取柱前衍生。以外标法计算得到BPA浓度、相对标准偏差(RSD)及萃取率(ER)，见表3。

　　3.2.3 方法的干扰实验 利用优化后DLLME条件萃取水样中等摩尔浓度(0.5 μmol/L)的5种雌激素(E1， E2， E3， EE2和BPA)，萃取分离效果见图2。在设定色谱条件下，BPA测定不受其它雌激素干扰。调整流动相比例或选用250 mm色谱柱，可同时定量分析水样中多种雌激素。 图2 BPA与其它雌激素分散液液微萃取柱前衍生的色谱图表3 不同BPA浓度的萃取衍生化定量分析

　　3.2.4 实际水样的测定 利用所建方法测定松花江某江段水、实验室自来水及某排水沟水样中的BPA，见表4， 图3 排水沟水样中BPA分散液液微萃取衍生化色谱图

　　Fig.3 BPA chromatogram in barreldrain water after DLLME and derivatization其中排水沟水样的色谱图见图3。表4 实际水样中BPA的加标回收率

　　3.3 方法比较

　　本方法检出限低于无衍生化HPLCUV测定BPA方法[17]约4个数量级，与MIPMHPLCUV测定BPA方法[9]处于同一水平，且低于HPLCFLD方法[15]3个数量级，可达到GCMS 方法[18～20]水平(表5)。此外，DLLME中沉淀相为有机相，可直接进行BPA衍生化反应，避免了样品脱水和氮气挥干环节，简化了BPA预处理步骤。表5 方法比较

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