人红细胞20S蛋白酶体的蛋白质组学表征及不同来源20S蛋白酶体异质性的研究

　　　　 作者：陈国强 刘辉 张海婧 邓艳春 李智立

【摘要】 通过整合差速离心和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)技术，建立了能有效分离20S蛋白酶体（20S core particle，CP）的方法。与传统纯化方法比较，此方法具有经济、快速的特点，并且能够对不同组织细胞来源的CP进行分离。利用本方法对人红细胞来源的CP亚基进行了2DE分离和MALDITOF/TOF MS鉴定。结果显示，可鉴定出33个具有不同相对分子量和等电点的蛋白点，此数量远远多于CP亚基的14种。此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDSPAGE）技术，比较了来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系SW1990和PANC1的CP及其亚基在电泳行为方面的差异，进行了蛋白酶体异质性初探。

【关键词】 蛋白酶体，异质性，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，差速离心，细胞系

　　1 引言
　　
　　20S蛋白酶体（20S core particle，CP）以不同的方式与其它蛋白酶体相关激活因子，如19S调节颗粒、11S调节颗粒（又称PA28）和PA200结合（未经特别说明，以下所称“蛋白酶体”包括CP以及CP与上述不同激活因子结合后形成的复合体），介导胞内蛋白降解并参与细胞周期调控、DNA修复、染色体稳定、转录激活、信号转导和抗原提呈等过程[1～3]。CP是一个相对分子量约为700 kDa的蛋白质复合体，由14种亚基组成，分别称为α1～α7，β1～β7，并共同形成一个桶状结构α7β7β7α7。
　　
　　传统的生化分离方法和基于抗体的免疫亲合层析技术目前仍然是CP分离的主要技术手段。前者作为经典的分离纯化方法，一般涉及选择性硫酸铵沉淀、甘油密度梯度离心以及液相色谱等步骤[4，5]，操作繁琐耗时。免疫亲合层析技术由于其操作简便，并可在数小时内完成，正越来越多地被应用于CP分离[6，7]。然而，免疫亲合层析技术涉及的抗体一般价格较贵，而且对不同物种来源的CP需要使用不同的抗体，限制了对某些物种来源的CP的研究。本研究采用了差速离心结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativePAGE）的方法对人红细胞内源性CP进行分离，然后利用蛋白质组学技术对CP各个亚基进行分离和鉴定；此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDSPAGE）技术对来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系SW1990和PANC1的5种CP进行了蛋白酶体异质性研究。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器、试剂和材料
　　
　　QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司），配有电喷雾离子源（ESI）及Analyst QS 1.1数据处理系统；X'TremeSimple Nano Ultra高效液相色谱系统（美国MicroTech Scientific公司），与QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪联用；Autoflex III基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪（MALDITOF/TOF MS，德国Bruker Daltonics公司），配有MTP AnchorChip样品靶和BioTool 3.1蛋白搜库软件（含Mascot蛋白搜索引擎的链接：http://www.matrixscience.com/）；二维凝胶电泳（2DE）系统（美国GE Healthcare公司），包括Ettan IPGphor III等电聚焦仪及DALTsix垂直电泳设备；超速离心机Optima XL80 （美国Beckman Coulter公司），配有SW 50.1离心转子。
　　
　　乙腈、甲酸和三氟乙酸（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、牛甲状腺球蛋白（相对分子量约为670 kDa，作为nativePAGE的相对分子量指示标准品）、酸洗玻璃珠（425～600 μm）和AgNO3(SigmaAldrich公司)；红细胞蛋白酶体标准品（含CP和26S蛋白酶体，美国Biomol公司）；测序级胰蛋白酶（罗氏公司）；二维凝胶电泳所需试剂和等电聚焦胶条IPG DryStrip（24 cm，pH 3～10，非线性，美国GE Healthcare公司）。
　　
　　在常规YPD培养基（含1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖）中培养的CG1945酿酒酵母；2月龄SPF级C57BL/6J小鼠的肝脏；人红细胞（北京市红十字会血液中心）；在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养的人胰腺癌细胞系SW1990；在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养的人胰腺癌细胞系PANC1。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 差速离心 在2 g酵母、2 g小鼠肝脏（已碾碎）、2 mL红细胞、2 g SW1990和2 g PANC1细胞中，分别加入4 mL裂解液（40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（TrisHCl）， pH 7.5）， 5 mmol/L MgCl2， 0.5 mol/L NaCl， 1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）， 10 mmol/L NaF和10 mmol/L Na4P2O7），4 ℃放置1 h（在酵母裂解液中加入酸洗玻璃珠进行机械振荡破碎），然后进行差速离心：115000×g，150 min，吸取上清；再对此上清液进行离心，243000×g，240 min，小心倒去上清液，用300 μL溶液（20 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）， 5 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L NaCl， 1 mmol/L DTT）将沉淀重悬后，离心去除不溶物，此上清液即为部分纯化的含CP的蛋白质混合物样本（crude CP，cCP）。
　　
　　2.2.2 NativePAGE、native/SDSPAGE和2DE nativePAGE按照文献[8]的方法进行。native/SDSPAGE的操作步骤：将经过nativePAGE后含CP的蛋白条带切下，用乙腈完全脱水后，加入50 μL溶液（250 mmol/L TrisCl（pH 6.8），20%甘油，2% SDS，40 mmol/L DTT和痕量溴酚蓝）。再加入300 μL水，静止60 min，吸取上清液，此步骤重复2次。将合并后的上清液真空抽干至一定体积（约50 μL）后，进行12.5% SDSPAGE分离。2DE的操作步骤：CP条带经脱色（50%乙腈和25 mmol/L NH4HCO3）和乙腈脱水后，加入550 μL溶液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% 3[3(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS），1.2% DestreakTM试剂和0.5% IPG Buffer（pH 3～10， 非线性）），将条带用镊子充分碾碎后再进行第一维等电聚焦电泳分离，之后进行第二维12.5% SDSPAGE分离。

　　2.2.3 蛋白酶切 切下经nativePAGE分离后的CP银染条带，用15 mmol/L K4Fe(CN)6和50 mmol/L Na2S2O3溶液将其脱色后，再进行胰蛋白酶酶切[9]，并将此酶切上清液进行LCMS/MS鉴定。切下2DE胶上蛋白点，按照文献[9]的方法进行脱色和酶切。

　　2.2.4 液相色谱串联质谱分析（LCMS/MS） MicroTech Scientific MN15C18WSS75EU反相色谱柱（15 cm×75 μm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈和0.1%甲酸水溶液；流动相B：100%乙腈和0.1%甲酸溶液；洗脱条件：0～60 min，5%～20% B；60～90 min，20%～30% B；90～120 min，30%～90% B；流速：0.3 μL/min；QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪ESI喷雾电压：2.6 kV；扫描范围： m/z 400～1500；数据依赖性扫描模式（informationdependent acquisition model），即进行1个全扫描后，选择3个信号强度最高的肽段离子进行MS/MS扫描。

　　2.2.5 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱（MALDITOF/TOF MS） 取胰蛋白酶酶切后上清液1 μL，点样于MTP AnchorChip靶上，室温自然干燥后，加上1 μL 0.67 g/L CHCA（用含70%乙腈和0.1%三氟乙酸的溶液配制），待完全干燥后进行MALDITOF/TOF MS鉴定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 CP的分离
　　
　　为了证明整合差速离心和nativePAGE能有效分离CP，本研究直接对经差速离心后得到的红细胞cCP进行了nativePAGE分离，并用AgNO3染色。如图1A所示，cCP经5.5% nativePAGE电泳1 kV·h后，在泳道cCP中观察到一条带的电泳迁移距离与蛋白酶体标准品中的CP（泳道M）相近。为了证明泳道cCP中的蛋白条带为含CP条带，切下该条带，并进行胶内胰蛋白酶酶切和LCMS/MS鉴定。结果显示，亚基α2序列中的 GYSFSLTTFSPSGK， LVQIEYALAAVAGGAPSVGIK， KLAQQYYLVYQEPIPTAQLVQR和LAQQYYLVYQEPIPTAQLVQR，α3序列中的HVGMAVAGLLADAR，SLADIAR和EEASNFR以及α4序列中的LAAERRNIHK得到了LCMS/MS鉴定，其中GYSFSLTTFSPSGK的MS/MS图谱如图1B所示，表明此质谱鉴定结果是可靠的。以上结果表明，通过整合差速离心和nativePAGE能对CP进行有效的分离。

　　图1 人红细胞CP的分离以及LCMS/MS鉴定（略）

　　Fig.1 Isolation and mass spectrometric identification of human erythrocyte 20 Ｓ core particle(CP)

　　(A) CP经5.5% nativePAGE后得到分离（5.5% ＮativePAGE isolation for CP）; (B) α2亚基序列GYSFSLTTFSPSGK的MS/MS图谱（MS/MS spectrum of GYSFSLTTFSPSGK of subunit α2）。

　　3.2 CP亚基的蛋白质组学表征
　　
　　为了证明利用本分离方法得到的CP是由14种亚基组成的完整复合体（α7β7β7α7），以及为了能够利用蛋白质组学技术在亚基水平上研究蛋白酶体异质性（Ｐroteasome heterogeneity），将来自nativePAGE上的CP进行了2DE分离，并将分离得到的亚基进行胰蛋白酶酶切和MALDIMS/MS鉴定。表1为每个蛋白点的质谱鉴定结果，除包含肽质量指纹图谱（Ｐeptide mass fingerprinting，PMF）信息外，还至少有一个肽段得到MS/MS鉴定。如图2和表1所示，经2DE分离和质谱鉴定后，33个具有不同相对分子量和等电点（pＩ）的蛋白点得到了鉴定，此数量远多于CP亚基的14种，表明其中大部分亚基存在着不同的亚型（Ｉsoform）。如图2所示，除α5， β5和β6外，其余亚基都含有不同的亚型。但此结果并不表示α5， β5和β6不含亚型，因为在对其它物种来源的CP亚基的研究中发现，血吸虫和大鼠肝脏中的α5和β6都存在不同亚型，大鼠肝脏和人红细胞中的β5也存在2种亚型[8，10，11]。产生上述结果的主要原因可能是2DE的pI分辨能力还不足以完全分离细微pI差别的亚型，或者在第一维等电聚焦电泳过程中碱性端（接近阴极）聚焦不好。翻译后修饰、信使RNA（mRNA）选择性剪切、点突变、蛋白质功能性水解和半胱氨酸侧链巯基化学修饰（如磺酸化、丙酰胺化等）等原因使CP亚基在2DE图谱上呈现出多种不同的亚型。
　　
　　研究证明[4，12]，蛋白酶体也存在多种不同的亚型，并且各种亚型具有不同的物化性质（如相对分子量、pI以及翻译后修饰等）和蛋白降解功能，此现象称为蛋白酶体异质性。Schmidt等[11]通过高分辨率阴离子交换色谱得到了5种CP亚型，对其中2种亚型进行了蛋白质组学分析比较，发现免疫型β亚基在第4种CP亚型中含量较高；Drews等[12]利用自由流电泳技术高分辨率的特点，对小鼠心脏和肝脏内的CP进行pI分离，发现小鼠心脏CP主要集中在pI 5.26，分布范围为pI 5.10～5.33；而肝脏内CP主要集中在pI 5.05，分布范围为pI 5.01～5.29。结合文献报道，蛋白酶体异质性产生的主要原因可能来自以下5个方面：（1）来自不同种属的个体、同一种属的不同个体、甚至同一个体不同细胞组织以及在不同生理或疾病状态下的蛋白酶体（见3.3节）；（2）蛋白酶体亚基存在多种不同的亚型。由于多种不同亚型的存在，使其组装的产物——蛋白酶体也具有多种不同的亚型，此为蛋白酶体异质性产生的主要原因；（3）当β1， β2和β5亚基被免疫型β1i、β2i和β5i亚基取代后，形成的免疫蛋白酶体具有不同的活性和功能；（4）外部调节蛋白（如激酶和磷酸酶等）对蛋白酶体活性和功能具有调节作用[13]；（5）蛋白酶体相关激活因子，如19S调节颗粒、11S调节颗粒（包括PA28α、PA28β和PA28γ）和PA200对蛋白酶体结构和功能的调节作用。

　　图2 CP亚基的2DE分离（略）

　　Fig.2 Twodimensional gel electrophoresis(2DE) profiling of CP subunits

　　表1 上述图2中33个蛋白点的质谱鉴定结果（略）

　　Table 1 Mass spectrometric identifications of 33 spots of CP subunit isoforms in Fig.2

　　3.3 5种不同来源CP的蛋白酶体异质性
　　
　　采用相同的离心条件同时处理酵母、小鼠肝脏、人红细胞、SW1990和PANC1细胞的裂解液，得到5种cCP样本，并对其进行nativePAGE分离。如图3A所示，5种不同来源的CP在nativePAGE胶上表现出不同的电泳迁移率，依次为酵母&>小鼠肝脏&>红细胞≈SW1990≈PANC1，此结果也充分解释了来自不同种属的CP具有不一样的物化性质（即蛋白酶体异质性），即在相对分子量、带净电荷数或分子大小等方面的差异，导致CP具有不同的电泳行为。将染色的CP条带切下，然后进行第二维12.5% SDSPAGE分离，并采用AgNO3染色，结果如图3B所示。CP亚基相对分子量主要分布在20～３0 kDa范围内。哺乳动物来源的这4种CP亚基之间的条带分布无明显差异；但与酵母来源的CP亚基相比较，哺乳动物来源的CP亚基分布在一个较窄的相对分子量范围内（即亚基条带重叠显著），且部分亚基相对分子量比酵母来源的CP亚基大，此差异可能是导致酵母来源的CP在nativePAGE中具有最大电泳迁移率的主要原因。此结果在一定程度上支持了上述关于蛋白酶体异质性产生原因的阐述。此外，除了CP亚基，亦可观察到其它蛋白条带，尤其是在酵母中。这些蛋白可能是正被蛋白酶体降解的底物蛋白，或者是与蛋白酶体相互作用的蛋白。由于该CP分离方法涉及的纯化条件相当温和（包括裂解、差速离心和nativePAGE分离条件），在纯化过程中将可能同时得到与蛋白酶体相互作用的蛋白，它们的存在可能使蛋白酶体的结构或功能发生改变，详尽的结果有待进一步研究证实。

　　图3 来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、SW1990和PANC1细胞的CP及其亚基电泳行为比较（略）

　　Fig.3 Electrophoretic behavior comparison of CPs and CP subunits from yeast， mouse liver， human erythrocytes， SW1990 and PANC1 cells

　　(A) 5种不同来源的CP经5.5% nativePAGE后得到分离（5.5% ＮativePAGE isolation for 5 CPs）; (B) 将得到的CP进行第二维12.5% SDSPAGE分离（Ｓecond dimensional 12.5% SDSPAGE separation for CP subunits）尤其酵母来源的CP其电泳迁移率远大于其它种属来源的CP。

　　4 结论
　　
　　通过整合差速离心和nativePAGE技术，对5种不同来源的CP进行了分离，表明本方法适合于分离不同组织细胞来源的CP，兼具快速、经济和有效的特点。而且，本研究利用蛋白质组学技术对CP亚基进行了分离和鉴定，并对蛋白酶体异质性进行了初步探讨。此研究结果为进一步阐明蛋白酶体的结构和功能提供了分子理论基础。

参考文献

　　1 Baumeister W， Walz J， Zuhl F， Seemuller E. Cell， 1998， 92(3): 367～380

　　2 Fruh K， Gossen M， Wang K， Bujard H， Perterson P A， Young Y. EMBO J， 1994， 13(14): 3236～3244

　　3 Morel S， Levy F， BurletSchiltz O， Francis B， ProbstKepper M， Peitrequin A， Monsarrat B， Velthoven R V， Cerottini J， Boon T， Gairin J E， Eynde B J. Immunity， 2000， 12(1): 107～117

　　4 Drews O， Zong C， Ping P. Proteomics， 2007， 7(7): 1047～1058

　　5 Lu H， Zong C， Wang Y， Young G W， Deng N， Souda P， Li X， Whitelegge J， Drews O， Yang P， Ping P. Mol. Cell. Proteomics， 2008， 7(11): 2073～2089

　　6 DucouxPetit M， UttenweilerJoseph S， Brichory F， MarriePierre B， BurletSchiltz O， Haeuw J， Monsarrat B. J. Proteome Res.， 2008， 7(7): 2852～2859

　　7 BousquetDubouch M P， UttenweilerJoseph S， DucouxPetit M， Matondo M， Monsarrat B， BurletSchiltz O. Methods Mol. Biol.， 2008， 432: 301～320

　　8 Elsasser S， Schmidt M， Finley D. Methods Enzymol.， 2005， 398: 353～363

　　9 Froment C， UttenweilerJoseph S， BousquetDubouch M P， Mariette M， Borges J P， Esmenjaud C， Lacroix C， Monsarrat B， BurletSchiltz O. Proteomics， 2005， 5(9): 2351～2363

　　10 CastroBorges W， Cartwright J， Ashton P D， Braschi S， Renata G S， Rodrigues V， Wilson R A， Curwen R S. Proteomics， 2007， 7(7): 1065～1075

　　11 Schmidt F， Dahlmann B， Janek K， Klob A， Wacker M， Ackermann， R， Thiede B， Jungblut P R. Proteomics， 2006， 6(16): 4622～4632

　　12 Drews O， Wildgruber R， Zong C， Sukop U， Nissum M， Weber G， Gomes A V， Ping P. Mol. Cell. Proteomics， 2007， 6(11): 2021～2031

　　13 Zong C， Gomes A V， Drews O， Li X， Young G W， Berhane B， Qiao X， French S W， BardagGorce F， Ping P. Circ. Res.， 2006， 99(4): 372～380