基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分析三七和海兔神经连索内的皂甙组分

　　　　　　 作者：冯丽剑 黄琳 卓慧钦 黄河清

【摘要】 基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDITOF）质谱技术能高效解吸三七提取液（Panaxnotoginseng Extraction， PNE）中的混合皂甙分子为皂甙离子，并供质量分析器检测与分析。选用MALDITOF 质谱技术直接分析色谱纯皂甙样品的纯度，其检测灵敏度优于反相高效液相色谱法（RPHPLC）。优化提取中药三七(Panax notoginseng， PN)的混合皂甙， 选用MALDITOF质谱技术直接分析PNE中的皂甙种类和相对含量，发现PNE至少含有20种不同分子结构的皂甙组分，其中人参皂甙(Ginsenoside) Rg1和三七皂甙（Notoginsenoside）R1含量相对较高。选用薄板层析法（TLC）制备PNE中的R1皂甙。MALDITOF质谱技术研究蓝斑背肛海兔(Notarcus leachiicirrosus Stimpson， NLCS)神经连索内的超微量R1的组成与分布。建立PNE皂甙的指纹图谱，并适合于评价中药三七的品质和分析体内超微量皂甙的代谢过程与机理。

【关键词】 三七，皂甙，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，指纹图谱

　　1 引言

　　人参(Ginsenoside)和三七(Panax notoginseng)是常用的名贵中药材之一，主要用于治疗各种出血瘀血之症以及跌打损伤，瘀滞肿痛，具有止血不留瘀和增强免疫力等独特功效[1，2]。皂甙是三七药材中的重要活性成分，由人参皂甙Rb1， Rg1， Re和三七皂甙R1组成[2]。近年来， PNS在神经系统疾病治疗方面和药理学研究已引起重视。三七皂甙（Panax notoginseng saponins， PNS）不仅具有增强记忆功能[3]，而且还是治疗许多神经退行性疾病相关的神经元死亡和记忆衰退等有效阻断剂[4]。有关PNS的药理尚不清楚，仅有少量的研究报道[3，5]，推测与目前尚未建立高效、高灵敏度且能连续监测的皂甙成分的分析技术有关。
　　
　　目前，已从三七的不同部位中分离出二十几种皂甙，其中多数皂甙与人参皂甙的成分相同，即为达玛烷型的20(S)原人参二醇型[20 (S) protopanaxadiol]，如：Rb1， Rb2， Rc， Rd等组分；20(S)原人参三醇型[20 (S)peotopanaxatriol]，如：Re， Rf， Rg1， Rg1， Rh1等组分，其中Rg1和Rb1含量最高[6，7]。除人参皂甙组分以外，PNS也含有三七皂甙，如: R1， R2， R4， R6， Fa， Fc， Fe等组分[8，9]，其中R1的含量相对较高。有关皂甙R1的药效和药理学的研究也甚少。
　　
　　采用柱层析法、高效液相色谱蒸发光散射法[10]、薄层层析法、液滴逆流层析法、气相色谱、高效液相色谱[11]和液质联用技术[12]，分离与鉴定色谱纯的人参和三七皂甙的分子结构与组成已见报道，但对制备质谱纯的皂甙单体且用于药物疗效的研究甚少，从而限制了深入研究皂甙药理学和皂甙免疫增强机理。
　　
　　MALDITOF质谱分析技术具有快速、简单、高灵敏度和高分辨率等特点，但用于直接分析皂甙分子结构与组成的研究报道也甚少。本研究采用MALDITOF质谱技术直接分析PNE和海兔神经连索内的皂甙组成和相对含量，本方法适合评价三七的药材品质、皂甙药效和体内代谢途径与机理。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　REFLEX Ⅲ 型MALDITOF质谱仪（德国Bruker公司）； 1100型高效色谱仪（美国Agilent公司）；GENESYSZ型紫外可见分光光度计（美国Water公司）； LABCONCO Fezone 18冻干机（美国Labconco公司）。
　　
　　三氟乙酸（TFA）和乙腈(HPLC级，德国Merck公司)； 胰蛋白酶（V5111，Promega公司); 基质； α氰4羟肉桂酸（HCCA，美国ICN生物医学公司）。

　　2.2 标准人参皂甙和三七皂甙提取与分离
　　
　　用超纯水分别配制0.1 g/L人参皂甙Rg1， Rb1， Re标准溶液。 以0.1 mg三七皂甙R1混合溶液，作为标准品。取三七粉末0.6 g，加入乙醇50 mL，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸至乙醇挥发干净，再加入50 mL超纯水溶解样品。按照文献[1，５]的HPLC方法分离与鉴定三七提取液中的皂甙成分与含量，制备色谱纯的皂甙单体。以乙腈为流动相A，以水为流动相B，在0～12 min，以0～19% A进行梯度分离；在12～60 min，以19%～36% A进行梯度分离。检测波长为203 nm。

　　2.3 薄层层析分离板制备
　　
　　取三七粉末0.5 g，加水5滴，搅匀。再加以水饱和的正丁醇5 mL，振摇10 min，放置2 h，离心，取上清液。加用正丁醇饱和的水3倍量，摇匀，放置使分层。取正丁醇层，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试液。取人参皂甙Rb1， Rg1， Re和三七皂甙R1加甲醇制成2.5 g/L的混合液，作为对照液。分别取供试品和对照液10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，冷风吹干。置于盛有展开剂的层析缸内展开，待展开剂的前沿距离硅胶板底部约1 cm，取出，挥干溶剂，均匀喷Ｈ２ＳＯ４乙醇显色剂后，在105 ℃加热10 min显色鉴定。
　　
　　TLC展开剂为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=５5∶35∶10混合溶液; Ｈ２ＳＯ４乙醇显色剂为V(Ｈ２ＳＯ４)∶V(乙醇) =1∶9混合溶液; 水饱和的正丁醇：取过量水加入正丁醇溶液中充分振荡，静置使其分层，取上层; 正丁醇饱和的水：取过量水加入正丁醇溶液中充分振荡，静置使其分层，取下层。
　　
　　2.4 海兔神经连索中的内含物提取
　　
　　按2.3节描述的方法制备三七的R1组分。海兔给药（R1）方式和海兔神经连索分离的方法均参见文献[1]。海兔神经连索内的多肽与皂甙组分均参见文献[1３，1４]。

　　2.5 质谱分析

　　２．５．１ 质谱基质配制 50 mmol/L α氰4羟肉桂酸（HCCA）/40%乙腈/60%的0.1%三氟乙酸水溶液：40 μL ACN＋60 μL 0.1% TFA，加入足量的α氰4羟肉桂酸，配成HCCA饱和溶液，然后超声处理5 min，8000 g离心5 min，取上清液使用，每次新鲜配制。

　　２．５．２ MALDITOF 质谱分析 吸取待分析样品0.8 μＬ与等体积基质均匀混合、点样，作质谱分析。质谱条件：脉冲氮激光（337 nm）作为离子解吸电离源。选用反射模式，离子源加速电压1为20 kV，加速电压2为23 kV，脉冲3 ns，离子延迟2000 ns，真空度114 ×10－7Torr为分析基本条件。平均每次测定样品的激光脉冲次数约120次。采用外标法标定多肽质谱峰峰位[1３]。

　　２．５．３ HPLCQTOF质谱分析 选用HPLCQTOF质谱仪测定三七皂甙提取液中的混合样品组分，佐证MALDITOF质谱技术鉴定PNE皂甙组成。

　　3 结果与讨论

　　3.1 RPHPLC技术鉴定皂甙标样的纯度
　　
　　选用RPHPLC技术分离皂甙标样Rb1， R1， Re和Rg1，拟了解皂甙标样是否已达到色谱纯纯度的要求，并获得图1结果。由图1可见，皂甙标样Rb1， R1和Re均达到较高的色谱纯度，而Rg1含有微量的杂皂甙（图1a1）。收集色谱纯皂甙标样，供定性和半定量分析中药三七内的皂甙组成和相对含量。

　　图1 RPHPLC技术分离皂甙标样的色谱图（略）

　　Fig.1 Chromatogram maps of standard saponin samples separated with RPHPLC

　　a． Rg1样品(Ｓamples); b． R1 样品(Ｓample); c． Re 样品(Ｓample); d． Rb1 样品(Ｓample)。

　　3.2 MALDITOF质谱技术分析皂甙标样的纯度
　　
　　若液质联用仪中的液相色谱无法分离混合皂甙为单一的皂甙单体，就难以用质谱检测器对不同皂甙种类、组成、结构进行逐一分析与鉴定。图2是采用MALDITOF质谱分析技术直接分别测定色谱纯的人参和三七皂甙质谱图。由图2可见，皂甙标准品Rb1， Rg1， Re和R1样品中，除了Rg1外，其余样品均混含有其它皂甙杂质，均属于非质谱纯皂甙样品。Rb1皂甙标样（图2a）中有4个不同质荷比的质谱峰，即m/z 788.72， 858.37， 1130.50和1146.50。通过皂甙标准分子量和相关文献资料对比后，推测对应的分子式为[Rg3+Li－H]+， [Rg1+FA+OH－3H]+（FA为甲酸根， MW:45 Da）， [Rb1+Na]+， [Rb1+Cl+3H]+，Rb1皂甙标样主要以Rb1为主，含有少量Rg3和Rg1杂质。图2b是Rg1标样的质谱图，其m/z 822.75的单一质谱峰，标样纯度已达到质谱纯， 推算出分子式为 [Rg1+Na]+。类似图2a结果， Re标样中也含有少量皂甙杂质，有3个质谱峰， 即m/z 788.87， 817.95和968.81， 推算出分子式为 [Rg3+4H]+， [Rg3+Cl]+， [Re+Na]+。比较图2c中质谱绝对强度，可获悉Re相对含量最高。在R1标样中（图2d）有6个质谱峰，m/z 774.89， 804.13， 828.61， 860.39， 876.29和 954.76; 经推算它们的分子式为 [R2+5H]+， [Rg1+4H]+， [Rg1+Na+5H]+， [Rg1+FA+OH－H]+， [Notoginsenoside Fc－FA+5H]+， [R1+Na]+。比较图1d相对质谱峰强度， 可获悉，类似Rb1标样（图2a）的纯度，R1标样中同样含有较高的其它皂甙杂质，但R1含量相对最高。显然，选用色谱纯的皂甙用于药理学和代谢过程的研究，可能因纯度不够，而影响实验结果的可信度，尤其推算的皂甙降解过程。选用MALDITOF质谱技术评价皂甙的纯度优于高效液相色谱法或其它HPLCMS法，适合于分析生物体内中微量或超微量皂甙组成、相对含量和分子结构。

　　图2 MALDITOF MS技术分析皂甙标样的质谱图（略）

　　Fig.2 Mass spectra of standard saponins samples analyzed with MALDITOF MS

　　a. Rg1 样品(sample); b. R1 样品(sample); c. Re 样品(sample); d. Rb1 样品(sample)。

　　3.3 MALDITOF质谱技术分析PNE皂甙组成
　　
　　来自MALDITOF质谱仪的激光和在基质辅助下能将混合皂甙分子转化成皂甙离子，并被TOF质量分析器分离与检测，显示对应的质谱峰（图2）。选用相同的分析技术，可获得三七皂甙提取液（PNE）内的混合皂甙质谱图（图3）。从图3显示的总质谱峰数可初步推算PNE样品中至少含有20种不同分子结构或组分的皂甙。根据皂甙的质荷比值不同和质谱峰簇涵盖质荷比范围，可将图3中显示的皂甙质谱峰划分为a， b， c和d区域，并进行逐一解释。图3a区由6个质谱峰组成，其m/z为 789.64， 805.58， 823.61， 839.56和859.49，推算所对应的皂甙分子式为 [Rg1－OH+7H]+， [Rg1+6H]+， [Rg1+Na]+， [Rg1+K]+， [Rg1+FA+OH]+， 显然图3a中的质谱峰均为Rg1组分。图3b区由m/z为905.53， 920.72， 955.78， 969.62和985.60的皂甙质谱峰组成。推算所对应的分子式为[Gypenoside ⅫFA]+， [Gypenoside Fc+5H] +， [R1+Na]+， [R1+Cl+2H]+和[Rd+K]+， 以R1和Re为主的皂甙样品。图3c区域由5个质谱峰组成， m/z为1072.71， 1080.09， 1131.67， 1147.65和1163.67，推算所对应的皂甙分子式为 [Rb2－5H]+， [Rb2+2H]+， [Rb1+Na]+， [Rb1+FA+Na+2H]+和[Rb1+2FA－5H]+。图3d也是由5个质谱峰组成，m/z为1217.70， 1233.69，1263.71， 1279.73和1320.73，推算所对应的皂甙分子式为 [Ra2+7H]+， [Ra2+Na]+， [Ra3+Na]+， [Notoginsenoside Fa+Cl+3H]+和[Notoginsenoside Fa +FA+Cl]+，但含量相对较低。
　　
　　图3 MALDITOF质谱技术测定PNE皂甙组分的质谱图（略）　　

　　Fig.3 Mass spectrogram of panax notoginseng(PNE) saponins measured with MALDITOF mass spectrometry

　　a. m/z 760～860; b. m/z 890～990; c. m/z 1000～1200; d. m/z 1200～1350.

　　参考图3中总皂甙各组分所对应的质谱峰绝对强度，其中m/z 789.64 [Rg1OH+7H]+， m/z 823.61[Rg1+Na]+， m/z 969.62[R1+Cl+2H]+， m/z 1131.67 [Rb1+Na]+， m/z 1147.65 [Rb1+FA+Na+2H]+对应的5个质谱峰的绝对强度明显高于其它皂甙组分，即Rg1， Rb1和R1含量明显高于其它皂甙组成，认为三七皂甙中的皂甙相对浓度可能为 CRb1&>CRg1&>CR1。Rg1， Rb1和R1总皂甙含量是中药三七的主要皂甙组成，这一结论与采用RPHPLC分离并鉴定Rg1， Rb1和R1皂甙含量占PNE总皂甙80%的结论是一致。为了佐证这些论点和实验结果，选用HPLCQTOF分析技术，进一步分析部分皂甙分子结构，进一步揭示选用MALDITOF质谱技术分析中药三七皂甙的组成和分子结构的可行性。

　　3.4 MALDITOF质谱技术分析由薄层色谱法制备R1皂甙的纯度
　　
　　TLC属于经典色谱法之一。由于TLC操作简便、色谱结果直观、显色方式可选性大以及兼分离鉴定双重功能和分离设备廉价等优点，故应用广泛。对于成分复杂不明，或含无挥发性、低紫外光吸收的中药的分离与鉴定，TLC显示出独特的优势。但TLC作为一种开放式的色谱分离系统，其色谱行为极易受外界因素的影响，其精度比HPLC低。根据色谱纯皂甙标样在硅胶层析板（TLC法）上显示Rf值，分离与制备PNE样品中的R1皂甙组分，并用于研究R1皂甙在海兔神经连索中的诱导、代谢和分布情况。图4是从三七中分离出的R1皂甙质谱图，显示了3个质谱峰，其质谱峰的数目少于R1标样，说明了选用TLC技术制备纯度较高的R1皂甙标样，所对应的皂甙质m/z为789.48， 818.58和955.54， 推算皂甙的基本分子式为[Rg1 +4H]+， [Rg1+OH+2H]+ 和[R1+Na]+。RPHPLC实验结果已指出，PNE中的R1和Rg1之间的出峰保留时间相当靠近，显示出较低的分辨率[1]，因而选用TLC分离PNE皂甙样品过程中，R1和Rg1组分之间也显示出较低的分辨率，造成R1样品中含有微量Rg3皂甙， 非质谱纯样品，但属于色谱纯R1皂甙样品，并用于研究生物体内R1皂甙的代谢途径和机理。　　

　　图4 TLC法制备三七R1皂甙的质谱图（略）

　　Fig.4 Mass spectrogram of R1 saponin prepared with TLC method in Panax notoginseng

　　3.5 MALDITOF质谱技术分析海兔神经连索中的R1皂甙
　　
　　海兔(Aplysia)中枢神经系统（Central nervous system， CNS）结构很简单，并具有易分离和细胞定位的特点，因而它的CNS一直是神经分子生物学的经典分析模型[1５，1６]。海兔神经连索起着神经节之间参与信号传导物质传递的通道，分析神经连索内的有机小分子、多肽、蛋白质组分，有利研究神经节之间的信号传动和海兔的行为表达机理。选用直接注射法，将色谱纯R1皂甙注入海兔体内，研究R1在神经节内的代谢途径，了解R1在神经连索内的传递情况。图5a（对照）是海兔神经连索的多肽质谱图。从图5a可见，海兔神经连索含有丰富的神经多肽和有机小分子，但多数组分含量均极低，难以采用现有萃取和富集技术获得足够量供质谱分析。图5b是海兔经R1诱导后的神经连索质谱图。图5b显示神经连索内不仅含有丰富的多肽，而且还发现R1和Rg1皂甙质谱峰，这意味着R1和它的杂皂甙Rg1借助神经连索为通道，在神经节之间进行传递与诱导，使海兔神经连索表达出差异蛋白质[1]。MALDITOF质谱技术适合于研究海兔神经节及连索内超微量的多肽、酶蛋白。

　　图5 MALDITOF质谱技术分析R1皂甙在海兔神经连索中的代谢与分布情况（略）

　　Fig.5 Metabolism and distribution of R1 saponin analyzed with MALDITOF mass spectrometry in the neural connective of Aplysia

　　a． 对照(Control); b． R1诱导的神经连索(Neural connective under the stress of R1)。

　　3.6 结论
　　
　　RPHPLC和TCL分离技术难以制备质谱纯的三七皂甙单体，以满足皂甙单体药理学和免疫增强途径与机理的研究。MALDITOF质谱技术能高效地将三七单味中药的混合皂甙分子转化成皂甙离子，供质量分析器进行分析与监控，不需要进行预分离，弥补现有RPHPLC和LCMS的不足，并具有高灵敏度，是目前用于鉴定人参和三气中药中的皂甙组成、相对含量和分子结构的最佳分析技术。
　　
　　MALDITOF质谱技术适合于建立中药三七皂甙的指纹图谱，并能为评价三七或人参的品质提供更加科学与合理的评价指标。MALDITOF质谱技术适合直接分析体内或神经节内的超微量皂甙含量和分布，为研究皂甙代谢途径和药理学研究提供简单且快速的新颖分析技术，弥补现已建立的RＰHPLC和LCMS分析技术的不足。
　　
　　由于不同分子结构的皂甙在MALDI样品靶上形成的离子化程度可能相似或不同，因而造成在相同皂甙浓度的条件下，不同结构的皂甙所产生的质谱峰强度可能有所差异，此结果直接影响到选用质谱峰强度定量分析皂甙含量的可信度。不同分子结构的皂甙所产生的质谱峰强度只能作为评估皂甙之间的相对含量，不能作为定量分析的依据。本方法也适合半定量分析铁蛋白H和L亚基之间的相对含量[１７，1８]。

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