作者：张雯迪 苏萍 杨屹 郭振泉
【摘要】 建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件：抗原包被浓度为2.0 mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2 mg/L，生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0 mg/L。在此优化条件下，方法的线性范围为0.1～1000 μg/L；检出限为0.03 μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%~102%。与酶标二抗体系ELISA法相比，BA-ELISA具有更高的灵敏度，适于低浓度氯胺酮的检测。
【关键词】 氯胺酮；单克隆抗体；生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法
Biotin-avidin Mediated Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Determination of KetamineZHANG Wen-Di，SU Ping，YANG Yi*，GUO Zhen-Quan(College of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029)(College of Life Sciences，Peking University，Beijing 100871)Abstract A rapid and sensitive method based on biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay(BA-ELISA) was established for the determination of ketamine.The optimal concentration of coated antigen and anti-ketamine monoclonal antibody were found to be 2.0 and 10.2 mg/L.The concentrations of biotinylated goat anti-mouse IgG(Biotin-IgG) and streptavidin-horseradish peroxidase(SA-HRP) were optimized and the optimum results were found to be 0.29 and 1.0 mg/L，respectively.The linear range of the presented method was from 0.1 to 1000 μg/L，and the limit of detection was found to be 0.03 μg/L.The recoveries of ketamine spiked in human serum and urine were between 94% and 102%.Comparing the result of traditional ELISA，the present BA-ELISA method had a lower detection limit for ketamine.The experimental results indicated that the present BA-ELISA method was specific and sensitive.
Keywords Ketamine；Ｍonoclonal antibody；Ｂiotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay
1 引言
氯胺酮(Ketamine)是苯环己哌啶的衍生物，属N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，主要用于小手术、小儿检查或诊断操作时麻醉诱导及辅助麻醉[1]。氯胺酮具有一定的兴奋、致幻和依赖性，近年来，其滥用现象日益严重。检测氯胺酮方法主要是色谱法[2~4]。由于生物样品的基体复杂， 前处理步骤繁琐，色谱方法不适合大量样品的现场检测。因此，建立一种快速、可靠和低成本的氯胺酮检测方法具有重要意义。
免疫分析具有特异性强、选择性好等优点，可对复杂体系中痕量物质进行快速灵敏检测，被广泛应用于生物学、医学等领域[5]。2003年，Tan等首次报道了由美国Neogen公司制造的氯胺酮试剂盒[6]。本实验利用制备的氯胺酮单克隆抗体，采用生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，检测人体血清和尿液样品中的氯胺酮，具有高特异性和高灵敏度等特点。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
GENIOS酶标仪(澳大利亚Tecan公司)；生化培养箱(哈尔滨东联电子技术公司)；96孔酶标板(美国Costar公司)；牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，美国Sigma公司)；生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)，酶标链霉亲和素(SA-HRP)和HRP标记羊抗小鼠IgG(北京博奥森生物技术有限公司)；溴代乙酰溴(山东金城医药化工股份有限公司)；氯胺酮、去甲氯胺酮和可卡因(中国药品生物制品检定所)；吗啡(青海制药厂)；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为重蒸的去离子水。
2.2 实验步骤
2.2.1 氯胺酮全抗原的合成 取100 mg氯胺酮和300 mg K2CO3溶于20 mL甲苯中，在氮气保护下向上述溶液中缓慢加入500 μL溴代乙酰溴[7]，常温搅拌5 h。将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣。将含有BSA的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得氯胺酮全抗原(Ketamine-BSA)。全抗原(Ketamine-OVA)的合成方法与Ketamine-BSA相同。
2.2.2 氯胺酮单克隆抗体的制备及纯化[8] 用制备好的全抗原多次免疫小鼠后，取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，获得氯胺酮杂交瘤细胞，经筛选和克隆化后，将稳定分泌氯胺酮单抗的杂交瘤细胞株进行冻存。实验时将其从液氮罐中取出传代培养，状态良好后注射入小鼠腹腔内，两周后收集腹水。采用优球蛋白法纯化所得腹水，用紫外-可见分光光度法测定，以公式Cprotein(g/L)=1.45A280－0.74A260计算纯化后氯胺酮单克隆抗体的蛋白浓度[9]，于－20 ℃保存。
2.2.3 生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法的测定步骤
参考文献
[10]，用抗原溶液包被96孔板，4 ℃下放置过夜。次日用明胶溶液封闭2 h，加入氯胺酮单克隆抗体和氯胺酮溶液温育1 h。再依次加入Biotin-IgG和SA-HRP，分别温育60和50 min。然后加入底物，15 min后终止显色反应。最后利用酶标仪测定450 nm的吸光度值。2.2.4 氯胺酮生物样品的测定 实验所用人体血清和尿液均来自健康捐赠者。将已知高、中、低浓度的氯胺酮加入上述血清和尿液样品中，同氯胺酮单克隆抗体混合，在优化条件下，采用BA-ELISA法测定。
3 结果与讨论
3.1 全抗原的合成
利用溴代乙酰溴对氯胺酮的仲氨基进行活化，活化后与BSA或OVA的氨基进行反应，获得氯胺酮全抗原(Ketamine-BSA或Ketamine-OVA)。以考马斯亮蓝法分别对Ketamine-BSA和Ketamine-OVA的偶联率进行测定，
图1 杂交瘤细胞染色体照片（放大600倍）（略）
Fig.1 Photos of somatic chromosomes of hybridomas(Magnification×600)结果分别为1∶20和1∶21，满足免疫反应的需求。
3.2 单克隆抗体的鉴定
对处于生长对数期的杂交瘤细胞进行染色体检测。如图1所示，杂交瘤细胞约有100条染色体，证明其为小鼠脾细胞（20对染色体）与Sp2/0细胞（36对染色体）融合而成。采用间接ELISA测定腹水效价，结果为1∶105。
3.3 抗原和抗体工作浓度的确定
分别以8， 4， 2和1 mg/L的全抗原包被酶标板，加入10倍比稀释的抗体溶液，按照2.2.3节操作步骤检测。
如图2所示，其中，C0为抗体储备液的浓度，C为10倍比稀释抗体的浓度。本实验选择2.0 mg/L作为抗原的最佳包被浓度，在此抗原浓度下，吸光度下降到最大值一半时的抗体稀释度为1000，所对应的抗体工作浓度为10.2 mg/L。
图2 抗原和抗体最佳工作浓度的测定（略）
Fig.2 Determination of the optimal concentrations of antibody and coated antigen
Ketamine-BSA：（■）8 mg/L；（●） 4 mg/L；（▲） 2 mg/L；（） 1 mg/L； C0和C分别为抗体储备液和10倍比稀释抗体的浓度（C0 and C are the concentrations of stock antibody solution and 10-fold serially diluted antibody solution ）。
3.4 Biotin-IgG与SA-HRP反应条件的优化
在Biotin-IgG不同的稀释度下，2倍比稀释SA-HRP，作吸光度与Biotin-IgG和SA-HRP稀释度的关系图(图3)，其中，C0为SA-HRP储备液浓度（2 mg/L），C为2倍比稀释SA-HRP浓度。再将不同稀释倍数的Biotin-IgG与SA-HRP反应的时间作图（图4），在50 min 后，反应均达到平衡，考虑到吸光度的大小及反应的完全性对分析结果的影响。实验的最佳条件：Biotin-IgG的稀释度为3500倍(0.29 mg/L)，SA-HRP的浓度为1.0 mg/L，与SA-HRP的反应时间50 min。
图3 不同稀释倍数Biotin-IgG与SA-HRP（2倍比稀释）反应曲线图（略）
Fig.3 Two-time serial dilution curve of streptravidin-horseradish peroxide(SA-HRP) in biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay(BA-ELISA) with primary concentration of 2 mg/L at different dilutions of biotin-lgG
C0：SA-HRP 2 mg/L， C：2倍比稀释SA-HRP（Two-time serial dilution）； Ketamine-BSA：2 mg/L； 抗体(Ａntibody)： 10.2 mg/L； Biotin-IgG：（■）1∶3500，(●)1∶5000，(▲)1∶7000 diluted(起始浓度(Primary concentration)：1000 mg/L）。
图4 不同稀释倍数的Biotin-IgG与SA-HRP反应的时间关系图（略）
Fig.4 Time curves of serially diluted biotin-lgG reacting with SA-HRP in ELISA
Ketamine-BSA：2 mg/L；抗体(Antibody)：10.2 mg/L；Biotin-lgG：（■）1∶3500，(●)1∶5000 and (▲)1∶7000 diluted（起始浓度(Primary concentration):1000 mg/L）。
3.5 方法的线性范围和检出限
以lg(C0/C)为横坐标(C0和Ｃ分别为氯胺酮的储备液和工作溶液浓度)、吸光度值A为纵坐标进行线性拟合。当氯胺酮的浓度在0.1~1000 μg/L的范围时，线性回归方程为A=0.1844+0.0298lg(C0/C)，r=0.9956。检出限为0.03 μg/L（S/N=3）。
3.6 方法的重现性与特异性
对5批样品进行5次重复测定，批内和批间的RSD分别为1.61%~3.10%和3.62%~8.33%。以去甲氯胺酮、吗啡和可卡因为交叉反应物，采用50%替代法测定本方法的特异性。从表1中可知，吗啡和可卡因的交叉反应率均小于1%；去甲氯胺酮约为10%，表明本方法的特异性良好。
3.7 氯胺酮生物样品的测定
取冰冻健康人血清和尿液样品，分别加入0.9， 9和90 μg/L的氯胺酮，测定结果见表2。回收率在94%~102%之间，RSD为1.31%~8.46%。
表1 抗体与氯胺酮、去甲氯胺酮、可卡因和吗啡的交叉反应率（略）
Table 1 Ｃross-reaction of ketamine，norketamine，morphine and cocaine
表2 氯胺酮在血清和尿液样品中的回收率（略）
Table 2 Recovery of ketamine in the serum and urine samples
： Mean±ＳＤ．
3.8 酶标二抗ELISA法测定氯胺酮
以某公司生产的氯胺酮单克隆抗体为对照，采用酶标二抗体系ELISA方法对氯胺酮进行测定。其工作曲线方程为A=0.1304+0.0716lg(C0/C)(C0和Ｃ分别为氯胺酮储备液和工作溶液浓度， r=0.9936，n=5)，线性范围为1～10000 μg/L，检出限为0.18 μg/L(S/N=3)。
由于生物素-亲和素之间的结合力极强(亲和常数高达1015 L/mol)，且一个亲合素分子上可以标记多个酶分子，因而采用放大体系可以提高ELISA的灵敏度[10]。实验结果表明，BA-ELISA法比酶标二抗体系ELISA法的线性范围向低浓度扩展一个数量级，检出限更低，本方法具有潜在的应用前景。
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