分散液液微萃取快速测定中药中4种呋喃香豆素化合物

　　　　作者：张彦杰 白小红 李利华 王泉德

【摘要】 建立分散液相微萃取（DLLME）与HPLC结合快速测定中药样品中呋喃香豆素类化学成分含量的方法。对影响萃取效率的因素进行了优化：在含2.5%(w/V) NaCl的1.5 mL样品溶液中加入50 μL CCl4和300 μL乙腈，分散均匀后，以3500 r/min离心3 min，吸取CCl4聚集相，用2倍于CCl4体积的甲醇溶解后进行HPLC分析。补骨脂素、氧化前胡素在0.006～6.00 mg/L范围内，欧前胡素、异欧前胡素在0.006～12.0 mg/L范围内线性关系良好；检出限为1.0～3.0 μg/L(S/N=3)； 相对标准偏差在2.3%～5.4%(n=5)；浓缩倍数为12.6～38.5倍；回收率97.5%～114.8%。将本方法应用于快速测定白芷及其制剂元胡止痛片中欧前胡素、异欧前胡素及微量成分补骨脂素、氧化前胡素的含量，结果令人满意。

【关键词】 分散液液微萃取，高效液相色谱法，呋喃型香豆素类化合物，白芷

　　1 引言
　　
　　白芷属伞形科植物，其有效成分香豆素类化合物具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功放。白芷中呋喃型香豆素类化学成分含量较高的有欧前胡素、异欧前胡素等，而补骨脂素、氧化前胡素等含量较低，不易测定。目前，香豆素类化合物的分离、提取方法有溶剂提取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、溶剂萃取法等，这些方法不仅费时而且有机溶剂用量大[1]。测定欧前胡素、异欧前胡素含量的方法有高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]等。分散液相微萃取具有操作简单、快速、灵敏、富集倍数高、样品净化能力强、有机溶剂用量少等特点[4～6]，已成功地应用于水样中微量元素铅[6]及菊酯类农药残留[7]，牛奶、蛋黄等中胆固醇[8]，尿液中精神药物[9]的分析。本实验研究了呋喃香豆素类化合物的分散液相微萃取行为并对中药中呋喃香豆素类化合物进行提取、分离、净化和浓缩，与高效液相色谱结合，快速测定了白芷及其制剂元胡止痛片中欧前胡素、异欧前胡素及微量成分补骨脂素和氧化前胡素的含量。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　LC10AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）。补骨脂素（批号：110739200612，含量≥98%）、氧化前胡素（批号：061210，含量≥99%）、欧前胡素（批号：110826200511，含量＞98%）、异欧前胡素（批号：110827200407，含量＞98%）对照品均由成都曼思特生物科技有限公司提供；白芷为市售品（产地：山西）；元胡止痛片（广西半宙天龙制药有限公司）；丙酮（天津市化学试剂三厂）；CCl4（北京化工厂）。其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 色谱条件 采用Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， Dikma Technologies公司），检测波长252 nm，流动相为V（甲醇）∶V（0.025% H3PO4）=75∶25，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL。

　　2.2.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：分别准确称取补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素对照品各10.0 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL，配制成浓度为400 mg/L的对照品溶液， 4 ℃冰箱保存。微萃取工作液制备：分别精密量取补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素对照品溶液各3.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为24.0 mg/L的混合工作液。取400 μL混合工作液于离心管中，加入浓度为2.48×105 mg/L NaCl溶液150 μL，用二次蒸馏水稀释至1.5 mL，即为分散液相微萃取工作液。供试品溶液的制备：将生药白芷捣碎，准确称定白芷粉末（０．４５　mm粒径）0.4 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇45 mL，超声处理（150 W，40 kHz）1 h，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液于4 ℃冰箱保存待用；取元胡止痛片，去包衣，研细，称取粉末2 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤。

　　2.2.3 实验步骤 在5 mL具塞尖底离心管中，加入1.5 mL微萃取工作液，50 μL CCl4（萃取剂）和300 μL乙腈（分散剂），振荡3 min，形成水/CCl4/乙腈的乳浊液体系，CCl4均匀分散在水相中，以3500 r/min离心10 min， CCl4聚沉到离心管底部，用微量进样器抽取聚积相CCl4，记录其体积，置于5 mL小烧杯中，用2倍于聚积相体积的甲醇溶解，供高效液相色谱分析。

　　3 结果与讨论

　　3.1 分散液液微萃取萃取条件的优化

　　3.1.1 萃取剂的种类及其体积对萃取效率的影响 考察了CCl4、氯苯、氯仿、二氯甲烷4种萃取剂对补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的萃取效率。实验发现，二氯甲烷/乙腈/水三者互溶不形成乳浊液，

　　图1 萃取剂对萃取效率的影响（略）

　　Fig.1 Effect of extraction solvent type on extract efficiency

　　样品体积（Sample volume）： 1.5 mL；待测物浓度（Concentration of analytes）： 6.00 mg/L； 乙腈(Ａcetonitrile)： 300 μL； 萃取时间（Extraction time）： 10 min；萃取剂体积（Extraction solvent volume）： 50 μL； 蒸发温度（Evaporation temperature）： 70 ℃； 转速（Rate）： 2000 r/min； n=3。其它3种萃取剂与乙腈及水形成乳浊液体系，结果见图1。由图1可知，CCl4对4种化合物均能达到最佳的萃取效果，故本实验选用CCl4为萃取剂。
　　
　　萃取剂体积与待测物富集倍数(EF)的关系为：ＥＦ＝VsR100Vsed=Ksed/sKsed/sVsedVs＋１（１）式中Ksed/s为待测物在聚积沉淀相和样品相中的分配系数，R为待测物的萃取率，Vsed和Vs分别为聚积沉淀相和样品相的体积。
　　
　　由式(1)可知：若（Ksed/sVsed）／Vs１时，ＥＦ＝Ｋsed/s， 浓缩倍数EF与Vsed、Vs或Vs/Vsed无关。若（Ksed/sVsed）／Vs１时，ＥＦ＝Vs/Vsed， 在一定的条件下，Vs越大或Vsed越小，即Vs/Vsed越大，被测组分的EF越大。
　　
　　本实验考察了不同体积的CCl4对4种待测物富集倍数的影响（见表1）。由表1可知，随着CCl4体积增加， Ｖsed增加，在相同Vs条件下，Vs/Vsed相比减小，EF降低，实验结果与理论推导一致。说明4种呋喃香豆素化合物在CCl4/乙腈/水分散液相微萃取体系中聚积沉淀相和样品相的分配系数Ｋsed较大，可通过增加Vs/Vsed相比，提高富集倍数。为了便于操作，沉淀相CCl4体积不能太小。本实验选用50 μL CCl4。

　　表1 不同体积的萃取剂（CCl4）获得的富集倍数（略）

　　Table 1 Enrichment factor achieved for different volume extraction solvent

　　a． CCl4体积（volume of CCl4）； b． 聚积沉淀相体积Vsed（volume of sediment）。

　　3.1.2 分散剂种类及其体积对萃取效率的影响 考察了与水和CCl4均互溶的甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃4种分散剂对补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素萃取效率的影响，结果见图2。由图2可知，乙腈作为分散剂对4种待测物的萃取效率较高，故本实验选用乙腈为分散剂。
　　
　　考察了不同体积的乙腈对4种待测物萃取效率的影响，结果见图3。由图3可知，随着乙腈体积的增加，萃取效率逐渐降低，为了便于操作，本实验选用乙腈体积为300 μL。

　　图2 分散剂对萃取效率的影响（略）

　　Fig.2 Effect of disperser solvent on extract efficiency

　　萃取剂 （Extration solvent）: CCl4 50 μＬ； 分散剂体积（Disperser solvent volume）: 300 μＬ； 其它条件同图１（The other conditions are the same as in Fig.1）.

　　图3 分散剂体积对萃取效率的影响（略）

　　Fig.3 Effect of disperser solvent volume(acetonitrile) on extract efficiency

　　其它条件同图2（The other conditions are the same as in Fig. 2）.

　　3.1.３ 离心转速对萃取效率的影响 由图4可知，随着转速的增加，萃取效率逐渐增加，达到3000 r/min时萃取效率基本保持稳定。这是由于随着转速的增加，CCl4/乙腈/水形成的乳浊液体系逐渐被破坏，达到3000 r/min时，乳浊液体系完全被破坏。在离心力的作用下分散在水中的CCl4载带待测物形成聚积相。本实验离心转速选用3500 r/min。

　　图4 离心转速对萃取效率的影响

　　Fig.4 Effect of centrifuging rate on extract efficiency

　　其它条件同图１（The other conditions are the same as in Fig.1）.

　　3.1.４ 盐效应对萃取效率的影响 考察了NaCl浓度对补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素4种待测物萃取效率的影响。结果发现，当NaCl浓度为2.5%(w/V)时萃取效果最佳，故本实验选择2.5%(w/V)的NaCl体系。

　　3.1.５ 萃取时间对萃取效率的影响 考察了萃取时间（萃取剂和分散剂的混合溶剂注入水相后离心前的一段时间）对4种待测物萃取效率的影响。结果表明，萃取时间对萃取效率没有影响，为了保证测定结果的精密度，本实验萃取时间选用3 min。

　　3.1.6 酸度对萃取效率的影响 由于补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的内酯结构在碱性介质中易于发生水解，使萃取效率降低。故本实验考察了不同pH条件对4种待测物萃取效率的影响。结果发现，溶液的酸度对4种待测物萃取效率的影响不大，故本实验在进行DLLME时没有加任何酸碱。

　　3.2 方法学实验

　　3.2.1 工作曲线的绘制 分别准确量取不同体积的4种对照品溶液，按照2.2.2项配制补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素的DLLME系列标准溶液: 0.006， 0.02， 0.06， 0.10， 0.20， 0.60， 1.00， 2.00， 6.00和12.00 mg/L。按2.2.3实验项操作，HPLC检测，利用色谱峰面积y对分析物浓度c(mg/L)进行线性回归，结果见表2。

　　表2 分散液相微萃取待测物的工作曲线参数（略）

　　Table 2 Analytical performance date by the dispersive liquidliquid microextraction(DLLME) method

　　3.2.2 精密度实验 按2.2.2项配制高、中、低3种浓度的标准溶液，按2.2.3项萃取，HPLC检测，每个浓度平行操作3次，日内精密度RSD＜3.8%。连续测定3日，日间精密度＜5.4%。

　　3.3 样品分析

　　3.3.1 白芷药材及元胡止痛片中4种化合物的回收率实验 分别精密称取白芷粉末（0.45 mm粒径）0.4 g及元胡止痛片2 g，各3份，分别加入高、中、低3种浓度的对照品溶液，按2.2.2项配制成加样回收率供试品溶液。取两种加样回收率供试品溶液各200 μL于离心管中，加入浓度为2.48×105 mg/L NaCl溶液150 μL，用水稀释至1.5 mL，按2.2.3项萃取，HPLC测定，分别平行测定5次，结果见表3。

　　表3 白芷药材和元胡止痛片的加样回收率实验 （略）

　　Table 3 Recovery experiment of Radix Angelicae dahuricae and Yuanhu Zhitong tablet

　　3.３．2 白芷药材及元胡止痛片中4种化合物的含量测定 按2.2.2项制备两种供试品溶液各3份，各取200 μL于离心管中，加入2.48×105 mg/L NaCl溶液150 μL，用水稀释至1.5 mL，按2.2.3项萃取，HPLC测定（色谱图见图5）。测得白芷药材和元胡止痛片中补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素的平均含量分别为28.1， 98.6， 961.5， 919.5 μg/g和9.6， 35.1， 289.7， 140.7 μg/g。

　　图5 白芷（A）和元胡止痛片（B）中4种化合物的液相色谱图（略）

　　Fig.5 Chromatograms of four analytes in Radix Angelicae dahuricae(A) and Yuanhu Zhitong tablet(B)

　　a. 萃取后（Ａfter microextraction）； b. 萃取前（Ｂefore microextraction）； c. 对照品色谱图（Chromatogram of stander analytes）． 1． 补骨脂素（Ｐsoralen）； 2． 氧化前胡素（Ｏxypeucedanin）； 3． 欧前胡素（Ｉmperatorin）； 4． 异欧前胡素（Ｉsoimperatorin）。

　　综上所述，本实验应用DLLME作为中药的样品前处理技术，测定了白芷及其元胡止痛片中欧前胡素、异欧前胡素及微量成分补骨脂素和氧化前胡素的含量。DLLME与其它的微萃取方式相比，具有操作简单、快速（浓缩与净化时间不足5 min）、灵敏、富集倍数高等特点，特别是对常规前处理方法难以分析的少量、微量活性成分或有害成分的分析具有重要意义。

参考文献

　　1 Shi RenBing(石任兵)， LiuBin(刘 斌)， Zeng LinLin(曾琳琳). China Patent（中国专利）， 101062069， 2007

　　2 Jia MinRu(贾敏如)， Wang MengYue(王梦月)， Jin QuMo(金曲嫫)， Ma YuYing(马逾英)， Tang ShengWu(唐声武)， Xiong Ying(熊 英)， Jiang GuiHua(蒋桂华). West China Journal of Pharmaceutial Sciences.(华西药学杂志)， 2003， 18(5)： 361～362

　　3 Liu JiZhu(刘基柱)， Liu Dan(刘 丹)， Gong HongQuan(龚红全)， Wu FuHai(毋福海). Journal of Chinese Medicinal Materials.(中药材)， 2008， 31(7)： 1081～1082
　　
　　4 Farahani H， Norouzi P， Dinarvand R， Ganjali M R. J. Chromatogr. A， 2007， 1172(2) : 105～112

　　5 Xie HongXue(谢洪学)， He LiJun(何丽君)， Wu XiuLing(吴秀玲)， Fan Lu(范 璐)， Lu Kui(卢 奎)， Wang MeiMei(王美美)， Meng DaWei(孟大维). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2008， 36(11)： 1543～1546

　　6 Naseri M T， Hosseini M R， Assadi Y， Kiani A. Talanta， 2008， 75(1): 56～62

　　7 Zang XiaoHuan(臧晓欢)， Wang Chun(王 春)， Gao ShuTao(高书涛)， Zhou Xin(周 欣)， Wang Zhi(王 志). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2008， 36(6)： 765～769

　　8 Daneshfar A， Khezeli T， Lotfi H J. J. Chromatogr. B， 2009， 877(4): 456～460

　　9 Xiong C， Ruan J， Cai Y， Tang Y. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2009， 49(2): 572～578