聚氨基黑10B/Nafion修饰电极上多巴胺的检测

　　　　　　 作者：王春燕 唐小风 田坚 由天艳

【摘要】 用电化学聚合法制备了聚氨基黑10B/Nafion修饰电极，利用循环伏安法研究了多巴胺在此修饰电极上的电化学行为。在磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）中，多巴胺在修饰电极上呈现可逆的氧化还原峰。其峰电位都随pH值的增加而负移。多巴胺氧化还原峰电流与其浓度在0.2～30 μmol/L范围内呈良好的线性关系； 检出限为1.0×107 mol/L。实验结果表明：本修饰电极具有良好的重现性、稳定性和较强的抗干扰能力。将此修饰电极用于多巴胺注射液和小牛血清中多巴胺的检测，结果令人满意。

【关键词】 修饰电极，氨基黑10B，Nafion，多巴胺，电催化

　　1 引言
　　
　　近年来，染料类聚合物薄膜修饰电极因其稳定性好，催化活性高，选择性强等优点而发展迅速，并在电催化、传感器等方面显示出良好的应用前景[1～3]。氨基黑10B属于弱酸性染料，以此物质为电极修饰剂的研究还未见报道。由于此染料带有电子给体氨基并含多个共轭体系，故该试剂也可能起到媒介体的作用。此外，该试剂苯环较多，修饰剂分子中苯环数目的增多有利于改善其电催化活性和稳定性[4，5]。
　　
　　多巴胺（DA）是哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质，它在机体内的浓度变化与精神活动有直接关系，对其测定方法的研究具有重要意义。由于DA具有较好的电化学活性，可用电化学方法测定其含量。然而生物体中大量抗坏血酸（AA）与DA共存，严重影响了DA的测定，因此构建了多种化学修饰电极来选择性地测定DA[6～8]。常规的方法是在电极表面修饰一层具有离子交换性质的选择性膜，Nafion作为一种具有优良的离子交换性质的选择性膜，本身带有负电荷，对DA具有富集作用，可提高测试的灵敏度；并且对AA具有排斥作用，因此减小了AA的干扰。
　　
　　为了进一步扩大修饰剂的种类，扩展修饰剂的应用范围，本研究以玻碳电极为基底，利用电化学聚合法，制备了聚氨基黑10B/Nafion修饰电极，研究了此修饰电极的电化学性质及其对DA的电催化氧化性能。实验结果表明，此修饰电极不仅对DA有良好的电催化作用，而且能有效排除AA的干扰。此外，该修饰电极具有制备简单、响应快、重现性、稳定性好、抗干扰能力强等优点。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　CHI832电化学工作站（上海辰华仪器公司）；酸度计（上海理达仪器厂）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；电化学实验用三电极系统； 以玻碳电极或修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）电极为参比电极。
　　
　　氨基黑10B（80%，Sigma公司，未经进一步提纯）； 5% Nafion（V/V，Aldrich公司）；多巴胺(Alfa Aesar公司)；抗坏血酸(上海化学试剂有限公司); 磷酸盐缓冲溶液（PBS）由0.1 mol/L Nah3PO4Na2HPO4配制，并用0.1 mol/L NaOH与0.1 mol/L H3PO4调节其pH值。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。

　　2.2 修饰电极的制备
　　
　　用粒径为0.3和0.05 μm的Al2O3乳液将玻碳电极（直径3 mm）抛光至镜面，用水冲洗干净，然后依次用HNO3（1∶1，V/V），无水乙醇和水超声清洗5 min。将处理好的电极放入0.1 mol/L h3SO4中，于－0.5～1.5 V下进行循环扫描处理至背景电流稳定为止。
　　
　　将预处理电极置于含0.1 mmol/L氨基黑10B的0.1 mol/L h3SO4中，在－1.0～2.0 V电位区间，以100 mV/s的扫描速度循环扫描进行电化学聚合。由于氨基黑10B聚合膜的厚度可由扫描圈数来控制，控制扫描20圈后取出，聚合后的电极用水清洗干净，然后在空气中自然晾干。
　　
　　用微量进样器取4 μL 0.5% Nafion滴加在上述制备好的电极表面，使之均匀地铺展在氨基黑10B聚合膜外面，室温下晾干，用水清洗干净即制得修饰电极，将其放入PBS(pH 7.0)中室温保存备用。

　　3 结果与讨论

　　3.1 电化学聚合条件的选择
　　
　　图1为氨基黑10B在0.1 mol/L h3SO4中电化学聚合时的循环伏安图。由图1可见，在1.0 V附近出现1个氧化峰，但没有出现对应的还原峰，这是由氨基黑10B单体在高电位下进一步氧化所产生的。由于该氧化还原产物伴随着聚合反应过程，所以不出现对应的还原峰[9]。随扫描次数的增加，这个峰的电流不断减小。

　　图1 氨基黑10B电聚合过程循环伏安图（略）

　　Fig.1 Cyclic voltammograms for electrochemically polymerization of amino black 10B (0.1 mmol/L) on GCelectrode
0.1 mol/L h3SO4， scan rate: 100 mV/s．

　　在0.3～0.6 V范围内出现两对氧化还原峰，随着扫描次数的增加，其峰电流逐渐增大；扫描20圈后，峰电流基本不变，吸附过程达到平衡。氨基黑10B在玻碳电极表面上的聚合过程很快，电极表面形成一层蓝黑色氨基黑10B聚合物膜，此膜附着力好，紧密均匀。
　　
　　扫描电位的上限对形成氨基黑10B聚合膜的影响很大。当扫描电位上限低于1.2 V时，氨基黑10B几乎不能发生电化学聚合，只能吸附在玻碳电极表面，这可能是由于氨基黑10B的聚合是通过其分子中的Nh3邻位自由基进行所致[10]。所以扫描电位上限一般要高于聚合单体的氧化峰，而且实验发现，当电位上限由1.2 V增加到2.0 V时，峰电流也随之增大；但上限电位大于2.0 V以后，峰电流基本不变甚至减小。扫描电位的下限不宜过负，需要保证没有h3析出。所以本实验选择－1.0～2.0 V的扫描电位。
　　
　　聚合物膜的厚度直接影响着溶液中的离子或电子向电极表面传输。膜厚度太大时，会导致电极的响应时间延长，反应的可逆性变差，影响测试的重现性。聚合物膜的厚度可以通过改变循环扫描次数来控制，本实验所用修饰电极是以100 mV/s的扫描速度循环扫描20圈得到的，此时对多巴胺的催化效果最明显。

　　3.2 Nafion用量的选择
　　
　　Nafion膜容易制备，化学稳定性好，离子交换容量大，能抵抗阴离子和许多生物分子干扰，所以得到了广泛的应用。为减小测定过程的干扰，在氨基黑10B的聚合膜表面滴涂了一层Nafion膜。Nafion用量对峰电流、峰形及稳定性都有影响。实验结果表明：峰电流随Nafion浓度先增大后减小。当体积分数为0.5%时，峰电流最大。因此本实验选择0.5% Nafion甲醇溶液4 μL。实验发现，在氨基黑10B聚合膜上滴一层Nafion膜，修饰电极使用寿命更长，这是Nafion膜起到保护作用所致。

　　3.3 修饰电极对DA的电催化氧化
　　
　　图2是2.0×10－5 mol/L DA在裸玻碳电极（曲线1）及聚氨基黑10B/Nafion修饰玻碳电极（曲线2）上的循环伏安图。DA的氧化还原峰电位差（ΔEＰ）在修饰电极上为114 mV，与裸玻碳电极相比，降低了118 mV，这表明氨基黑10B聚合膜的存在明显加速了电子传递速率；且峰形良好，这表明在修饰电极上，DA的电化学反应的可逆性得到了显著改善；同时DA的峰电流大大增加，这主要是由于电活性面积增大，对DA的电化学氧化有强烈的催化作用。这种催化作用主要来自以下原因：DA在PBS（pH 6.0）中带正电荷，而聚合物膜中的氨基黑10B带负电荷，两者静电吸引；DA中的羟基与聚氨基黑10B膜中的氨基形成氢键，使DA易吸附在修饰电极表面； Nafion本身带有负电荷，对DA具有富集作用。

　　3.4 扫速的影响
　　
　　图3A是2.0×10－5 mol/L DA在聚氨基黑10B/Nafion修饰玻碳电极上于不同扫速下的循环伏安图，其氧化还原电流与扫速呈线性关系（图3B），说明DA在修饰电极上的电极过程为吸附过程，氧化还原受表面控制。这与文献[11，12]所报道的DA在一些修饰电极上的电极过程为吸附过程一致。
　　
　　图2 DA在玻碳电极（曲线1）和聚氨基黑10B/Nafion修饰电极（曲线2）上的循环伏安图（略）

　　Fig.2 Cyclic voltammograms of dopamine(DA) at glassy carbon electrodes(curve 1) and poly(amino black 10B)/Nafion modified glassy carbon electrode (curve 2)

　　0.1 mol/L PBS (pH 6.0)， scan rate: 100 mV/s．

　　图3 (A) DA在修饰电极上不同扫速时的循环伏安图；(B)相应的氧化还原峰电流与扫速的线性回归曲线（略）

　　Fig.3 (A) Cyclic voltammograms of DA at modified electrode in pH 6.0 PBS at different scan rate (from inner to outer: 20， 40， 60， 80， 100 mV/s). (B) The plot of redox peak current vs. scan rate

　　每次测定DA后，将修饰电极取出用水冲净，置于pH 7.0的空白PBS中循环扫描，即可恢复其催化活性。

　　3.5 pH值的影响
　　
　　考察了扫速为100 mV/s时，2.0×10－5 mol/L DA在pH=2.0～9.0的PBS中的电化学响应（图4A）。实验发现：随着pH值的增大，DA的氧化还原峰电位均发生明显负移，且氧化和还原峰电位与pH值都呈较好的线性关系（图4B）。方程的斜率接近理论的能斯特斜率，说明DA在修饰电极上的氧化还原是等电子等质子过程。从图4A可以看出，pH=6.0时，峰电流最大，峰形较好，故实验选择pH=6.0的PBS为背景缓冲溶液。

　　图4 DA在不同pH值PBS中的循环伏安图(A)及相应的氧化还原峰电位与pH值的线性回归曲线(B)（略）

　　Fig.4 (A) Cyclic voltammograms of DA (2.0×10－5 mol/L) at modified electrode in various pH solutions. (B) The redox peak potentials as a function of pH
　　
　　Scan rate: 100 mV/s．

　　3.6 线性范围和检出限
　　
　　图5（A）为不同浓度的DA在修饰电极上的循环伏安图。显然随着DA浓度的增加，相应的氧化还原电流明显增大。在0.2～30 μmol/L范围内，DA的浓度与氧化还原峰电流呈良好的线性关系（见图5B）。氧化峰电流的线性回归方程为ipa(μA)=－1.842－0.7402C（10－6 mol/L)，r=0.9993；还原峰电流的线性回归方程为ipc(μA)=1.873+0.4172C（10－6 mol/L)， r=0.9991。检出限为1.0×10－7 mol/L(S/N=3)。

　　3.7 重现性与稳定性
　　
　　氨基黑10B聚合膜修饰玻碳电极在PBS（pH 6.0）中于－0.5～0.8 V间连续扫描100圈，扫速为100 mV/s，峰电位基本不变，峰电流仅下降了1.52%，此电极放置一个月后仍保留原有活性。用此修饰电极，对含2.0×10－5 mol/L DA溶液连续平行测定8次，测定结果的相对标准偏差为1.47%，此修饰电极放置一个月后（测1次/天），对相同浓度的DA的响应仅下降5.2%，表明此电极的重现性和稳定性良好。

　　图5 不同浓度的DA在修饰电极上的循环伏安图(A)和浓度与氧化还原峰电流关系图(B)（略）

　　Fig.5 (A) Cyclic voltammograms of DA at modified electrode in PBS (pH 6.0) at 100 mV/s; (B) the plot for concentrations of DA vs. redox peak current

　　Concentration of DA(1～7，10－6 mol/L): 0.2， 1.0， 2.0， 5.0， 10， 20， 30．

　　3.8 干扰实验
　　
　　由于本修饰电极上有一层Nafion膜，其选择性明显提高。在2.0×10－5 mol/L DA溶液中考察了AA及一些常见的阴离子以及氨基酸对修饰电极的干扰情况。实验结果表明：100倍AA浓度对DA的氧化峰电流无影响。此外，200倍K+、 Na+、 Cl－、 NO－3、葡萄糖以及100倍柠檬酸，50倍L赖氨酸、甘氨酸、酪氨酸和半胱氨酸均不干扰DA的测定。

　　3.9 样品分析
　　
　　取适量盐酸多巴胺注射液（10 g/L， 2 mL/支）样品，用水稀释10倍，再用0.1 mol/L PBS（pH 6.0）稀释到所需浓度，用聚氨基黑10B/Nafion修饰玻碳电极进行循环伏安测定，分析结果如表1所示。实验结果表明，本方法可用于药物样品中DA的定量测定。

　　表1 注射液中DA测定结果（略）

　　Table 1 Determination results of DA in injections(n=5)

　　采用此电极测定小牛血清中的DA。所有血清在检测前均用PBS （pH 6.0）稀释20倍，而没有其它的预处理过程。用标准加入法测定回收率，分析结果如表2所示，加标样品的回收率为96.0%～99.0%，表明检测过程不受血清基质干扰。

　　表2 小牛血清中DA测定结果（略）

　　Table 2 Determination results of DA in calf serum(n=5)

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