全二维微柱液相色谱质谱鉴定人胃癌组织中的差异蛋白质

　　　　 作者：罗福文 ， 陶定银 赵鹏 张丽华 贾玉杰 张玉奎

【摘要】 构建了以阳离子交换色谱反相色谱(SCXRPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱质谱分离平台。采用了醋酸铵缓冲液梯度洗脱，实现了第一维肽段的分步洗脱，洗脱的肽段经富集除盐后通过接口进入反相色谱微柱，通过线性梯度实现第二维进一步分离，最后进入质谱进行检测。采用此平台分析了人胃癌组织与正常组织提取蛋白质信息，其中正常胃组织鉴定蛋白质数为537个，而癌症组织鉴定蛋白质数目为506个。对胃癌和正常组织两种提取蛋白质酶解产物的蛋白质检索结果进行比较分析，将鉴定的蛋白质按照物理性质进行分布，找出正常组织与癌症组织间蛋白质差异，筛选出一种可能发生变异的癌症特有蛋白。

【关键词】 胃癌组织， 蛋白质组， 二维液相色谱质谱联用

　　 　　 1 引 言

　　胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居第4位。每年约有64万人因胃癌死亡，居癌症死因的第2位。胃癌也是我国最常见的恶性肿瘤，全世界约有35%的胃癌病例发生在中国，据估计2000年我国胃癌死亡率为24.65%[1]。通过蛋白质组学技术筛选胃癌组织有关的标志物是目前胃癌的研究热点，也是早期诊断的关键[2，3]。Ha等[4]对正常人胃组织进行二维电泳(2DE)分离，建立了正常人胃组织的蛋白质的2DE图谱，并用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDITOFMS)鉴定了其中的部分蛋白，包括胞浆蛋白、线粒体蛋白、核蛋白、内质网蛋白、微体蛋白和溶酶体蛋白。刘池波等[5]采用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片检测胃癌患者血清蛋白质指纹图谱，筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，并探讨其诊断早期胃癌的临床意义。马波等[6]利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胃癌组织和正常对照组织的总蛋白质， 并通过质谱分析技术对9个差异蛋白质点进行检测， 以确定胃癌的差异蛋白质。

　　二维液相色谱质谱联用作为蛋白质鉴定方法的高效手段一直受到广泛应用[7，8]。Link 等[9]开发了并改进了阳离子交换/反相/多级质谱联用(SCX/RP/MS/MS)的方法，采用SCX和RP一体柱直接进行二维液相色谱的分析，并与传统的方法进行比较。Wang等[10]采用整体柱制备阳离子交换/反相(SCX/RP)一体柱，并应用于酵母细胞提取蛋白质酶解产物分析，在12 h内鉴定了780个蛋白质。以上方法都是采用一体柱并且在纳升级流速下完成实验，柱制备和连接困难。王智聪等[11] 采用常规尺寸的色谱柱构建了正交的GFC/RP 二维液相色谱分离系统，并应用于山羊血清样品的纯化分析。

　　在本实验室前期工作[12]的基础上，采用传统的大内径SCX柱作为第一维色谱分离柱，第二维采用微升级的反相色谱分析柱，方便地构建了二维液相色谱质谱联用平台。比较胃癌组织与正常胃黏膜组织的蛋白质差异，为研究胃癌发病机制、寻找胃癌的标志物提供了有价值的资料。通过对提取胃组织蛋白质胰蛋白酶酶解，采用二维液相色谱质谱联用(2D LCMS/MS)对其组分进行检测，比较鉴定蛋白质在各种特性上的差异，以寻找可能发生病变的蛋白质，为医学检测和治疗提供参考。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　匀浆器，超声波破碎仪(美国ColeParmer公司);Paradigm GM4 microscale液相色谱 (美国Michrom Bioresources 公司);LCQ 离子阱质谱 (美国Thermo公司)，SEQUEST算法用于蛋白的数据库搜索。

　　尿素(Invitrogen公司);二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)等(美国Acros公司)。酶解过程采用Trypsin TPCK treated蛋白酶(美国Sigma公司)。蛋白质提取过程采用的蛋白酶抑制剂为Protease Inhibitor Cocktail Set I(德国Merck公司)。

　　二维液相柱系统：自填装的SCX捕集柱(10 mm×4.6 mm i.d.)，聚合物填料，颗粒直径5 μm，孔径50 nm(深圳纳微公司);RPTRAP：自填装C18预柱柱(50 mm×0.3 mm i.d.); XBP填料: 颗粒直径5 μm，孔径20 nm(天津博纳公司);反相C18分析柱(40 mm×0.5 mm i.d.)， XBP填料，颗粒直径5 μm，孔径20 nm(天津博纳公司)。

　　2.2 样品准备

　　取胃癌病人的胃组织，其中包含正常的组织和癌症组织。正常组织比较软，且颜色与正常胃组织一样。而癌症组织则呈明显的黄色，且透明化，硬度大，不易剪碎提取。将两个组织分别放到表面皿中并在冰上剪碎，以含1 mmol/L蛋白酶抑制剂Protease Inhibitor Cocktail Set I的8 mol/L尿素为蛋白提取液进行冰上匀浆。然后在功率为85 W时，工作10 s，停止10 s，循环超声5次，提取蛋白。在4 ℃下以16000 r/min离心30 min，取上清液蛋白溶液，采用考马斯亮蓝(BRADFORD)法测定蛋白质浓度。

　　将提取的正常组织与癌症组织蛋白溶液各取125 μL和 100 μL，对应蛋白质含量为1 mg，分别加入8 μL 1 mol/L DTT，在56 ℃条件下反应2 h，然后加入20 μL 1 mol/L IAA避光反应30 min，用50 mmol/L TrisHCl (pH 8.3)稀释到1 mL，按质量比1∶50加入胰蛋白酶，37 ℃ 摇床反应24 h，取出加2 μL甲酸进行酸化，-20 ℃保存备用。

　　分 2.3 二维LCMS/MS系统建立及样品分析

　　采用自动进样器和二元梯度体统构建的二维LCMS/MS系统如图1所示。首先，采用连有C18预柱的十通阀接口连接SCX柱和C18 HPLC柱。通过自动进样器以台阶梯度将不同浓度的醋酸铵溶液输送至离子交换柱上，实现第一维肽段的分级洗脱。分级洗脱的肽段由十通阀接口进入C18预柱，经富集除盐后，导入C18反相色谱柱，实现第二维分离。 图1 二维分离系统框架图

　　一维SCX分离采用醋酸铵缓冲液梯度洗脱，醋酸铵缓冲液浓度分别为0，20，100，200，300，500，1000和2000 mmol/L;流速：50 μL/min; 取正常部分组织提取蛋白质和癌症部分组织提取蛋白质的酶解产物各100 μg(以总蛋白定量)进样分析。

　　第二维反相分离流动相为A: 98% h3O+2% ACN 0.1% FA;B: 98% ACN +2% h3O0.1% FA;梯度条件：0～70 min，B线形增加到40%，70.1 min， B增加到80%，并维持10 min，总时间为80 min;流速：5 μL/min。

　　质谱分离条件：2.0 kV， 150 ℃，一个全扫描质谱跟两个二级质谱，并设定动态排除。

　　2.4 蛋白质检索

　　采用BioWorks软件搜索，数据库为Human库，版本为3.1。搜索结果按照如下参数： +1价离子，Xcorr ≥1.9;+2价离子，Xcorr ≥2.2;+3价离子，Xcorr ≥3.75， ΔCn&>0.08筛选。

　　3 结果与讨论

　　3.1 二维液相色谱分离平台的优化

　　二维液相色谱分离平台的构建， 分别考虑了色谱柱的选择、洗脱液体积、样品洗脱切割的次数、捕集柱的选择以及反相色谱流动相的选择等多种因素[12]。通过对二维液相色谱分离条件进行了一系列优化，建立了二维微柱液相色谱分离平台分析方法。第一维采用离子交换色谱柱并选用台阶梯度方式进行洗脱。实验发现，20倍柱体积洗脱液较合适，避免发生无法有效洗脱和过度洗脱。适当增加洗脱台阶有利于降低进入第二维馏分的复杂性。通过条件优化，采用了8个醋酸铵缓冲液梯度对离子交换柱上吸附的样品进行粗分。选择C8基质的预柱并采用反冲的洗脱方式将富集在捕集预柱的样品洗脱进入反相柱分离。0 mmol/L台阶有较多洗脱峰。这是由于样品酶解后并没有经过除盐过程，导致一系列的杂峰在此被洗脱。另外，酶解产物中有一些等电点比较小的肽段在SCX柱上保留很弱，或者几乎不保留，也在此台阶出峰。数据库检索结果表明： 癌症组织与正常组织蛋白提取物在第一个台阶分别只鉴定到8种和16种蛋白质， 多数肽段在0～40%乙腈条件下得到洗脱。因此，适当增加这一区域的分离时间有利于提高多肽样品的分离度。然而，梯度时间过长，会增加整个系统的分析时间。

　　3.2 二维液相色谱分离结果

　　第一维分别采用8个不同浓度的醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱下来的蛋白质再进行反相LCMS/MS鉴定，分析谱图见图2和图3。从图2和图3可见，两种样品在各个台阶上都分离出很多峰，第一维保留的肽段按照盐梯度依次洗脱进入第二维的分析，从而降低第二维的分析压力，鉴定更多的蛋白质。

　　3.3 2D LCMS/MS分离平台鉴定

　　对所得结果按照2.4的条件进行搜索，二者鉴定的结果很类似，鉴定出多于500个蛋白质。这也说明这两种蛋白质提取产物的酶解产物混合物含有蛋白质数量接近，在同样上样量的条件下鉴定的数目接近。对每个梯度鉴定的蛋白质数目进行统计(如图4)，各个梯度鉴定的蛋白质数目分布走势图很类似，这也充分说明此方法的稳定性很好，鉴定的结果可信度很高。选取不同部位癌症和正常组织采集的样品多次重复进样，使用二维液相色谱分离每个梯度，其鉴定数目出现的变化趋势和鉴定蛋白质数目都高度相似，说明此方法重现性良好。 图4 各个梯度鉴定蛋白质数目分布

　　Fig.4 Numbers of identified proteins at different steps

　　3.3.1 鉴定蛋白质的理化性质比较 蛋白质的分子量和等电点是其最基本的两个物性指标。如果蛋白质发生变化，其等电点和分子量也都会发生相应的变化，可能会导致某些区间的蛋白质数目增加，同时也会带来其它区间蛋白质数量的降低。图5为两种组织鉴定蛋白质的分子量分布图;图6为两种组织鉴定蛋白质的等电点分布图。

　　从图5可见，正常组织中30～40 kDa的蛋白质数目明显多于癌症组织，而癌症组织中分子量大于80 kDa蛋白质的数目要远远多于正常组织。这也说明癌症组织的蛋白质分子量偏大。由图6可见，两种组织提取蛋白质等电点分布比较类似，但是在等电点5～6的范围中，胃癌组织的蛋白数明显要高于正常组织，而在等电点4～5及6～7范围中，正常组织蛋白质数目高于癌症组织。

　　图5 两种组织蛋白质的分子量分布图

　　Fig.5 Distribution of molecular weight of proteins in two tissues 图6 两种组织蛋白质的等电点分布图

　　Fig.6 Distribution of proteins pI of in two tissues3.3.2 差异蛋白质分析 通过对癌症组织和正常组织蛋白质检索结果进行对比分析(表1)，癌症组织鉴定出的置信度较高的(得分&>80)蛋白质30种，正常组织中则鉴定出了22种蛋白质。对比分析二者鉴定丰度最高的前30种蛋白质检索结果：正常组织中的10种主要蛋白质(丰度高的)未能从癌症组织中检出，而癌症组织中则有1种特有蛋白质未在正常组织中检出。此外，还有一些蛋白虽然在正常组织与癌症组织中同时存在，但丰度存在较大差异。上述差异蛋白可能是癌症相关蛋白质。表1 癌症组织及正常组织差异部分蛋白质鉴定信息

　　3.210钙网蛋白前体;干燥综合征抗原A Calreticulin precursor; Sicca syndrome antigen A4.2948142.2癌症组织特有蛋白质 Unique proteins in cancer tissue11类似于肌动蛋白(人类) Similar to beta actin [Homo sapiens]5.4641650.5 综上可见，经过二维液相色谱分离蛋白提取液酶解产物并通过MS/MS鉴定，可以找出可能的差异蛋白质。这些蛋白质经过生物信息学的分析为将来药物靶点、药物作用通路的研究提供更多信息。

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