亚硒酸钠在L半胱氨酸自组装类生物膜修饰电极上的电化学行为

　　　　　　作者：温金凤 朱爱花 崔胜云

【摘要】 利用L半胱氨酸自组装膜修饰金电极（LCys，Au/SAMs）， 在0.05mol/L h3SO4 底液中研究了 Na2SeO3 的电化学特性。在0.00～1.30 V (vs. SCE) 电位范围内对微量Na2SeO3进行循环伏安扫描，发现LCys， Au/SAMs修饰电极在峰电位0.89 V处有灵敏的Se的氧化溶出峰。通过比较裸金电极和修饰电极在Na2SeO3 溶液中的电化学特性发现，修饰电极通过巯基中的S与Na2SeO3发生氧化还原作用生成Se，且修饰电极对沉积在电极表面的Se的氧化过程具有催化作用。根据Na2SeO3在单分子膜上的电化学行为，提出了单分子膜中硫（AuS）与Se作用生成Se的反应机理、Se电化学催化氧化机理及巯基化合物通过生成纳米硒生物吸收Se的类生物膜模型。

【关键词】 L半胱氨酸， 亚硒酸钠， 修饰电极， 纳米硒，伏安法

　　１ 引言
　　
　　半胱氨酸残基的巯基与Na2SeO3的相互作用研究多集中于还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基和Na2SeO3的相互作用[1，2]。因为Na2SeO3的生物利用过程须通过与GSH的巯基相互作用的代谢途径完成[3]。Na2SeO3的生物利用过程是通过与细胞内GSH的巯基跨膜氧化还原作用，依次把Se还原成硒代谷胱甘肽(GSSeSG)和SeH4。一部分SeH4经磷酸化过程生物合成硒蛋白来被生物体利用，还有一部分经甲基化排泄到体外。上述代谢模式中值得关注的是： (1)Na2SeO3对生物体而言是外源性的，它与细胞质内GSH的巯基间的跨膜氧化还原反应是生物利用硒的最重要的反应;（2）细胞质内的巯基和胞外的Na2SeO3经跨膜氧化还原作用，在细胞内生成不同价态的硒的化合物。这种胞内含硒作用产物的多样性决定了硒的生物学功能的多样性。

　　近年来，在均相的液相体系中Na2SeO3被巯基等还原型基团作用后生成的纳米级红色元素硒受到人们的关注[4]。Kessi等[5]研究细菌Rhodospirillum rubrum时发现，亚硒酸盐与该细菌作用时，细胞内生成红色纳米硒，且这种纳米硒通过细胞膜外排，也可被细胞跨膜吸收。文献[6，7]通过动物实验对红色纳米硒的生物活性进行了证实。尽管目前对红色纳米硒的生物化学反应机理未作详细的阐明，但红色纳米硒的跨膜吸收或外排及其生物活性作用与细胞内含量最丰富的GSH的巯基相互作用密切相关。因此，设计一种仿生界面来研究Na2SeO3在巯基相联的电极界面上的电化学作用，对揭示生物利用硒的机理及硒在生物体内的活性形态都有重要意义。
　　
　　L半胱氨酸自组装膜(LCys Au/SAMs)修饰电极是分析化学研究的热点之一。 这种巯基构成的单分子膜对仿生界面上巯基与各种生物活性物质在氧化还原过程中的电子传递过程、分子识别和选择性响应等生物电化学过程具有可模拟性[8]。由于LCys Au/SAMs中的硫原子与电极表面直接相连，当电极上发生电化学反应时，硫原子起到电子传递媒介体的作用。因此，电活性生物活性物质在单分子膜上的电化学特性间接反映了这些活性物质与硫原子相互作用的特性。本实验利用LCys Au/SAMS修饰金电极为工作电极，利用循环伏安法（CV）比较研究了Na2SeO3在裸金和修饰电极上沉积Se和Se 氧化溶出过程中的电化学特性，探讨了电极表面S和Se的作用机理及修饰电极对Se的氧化溶出过程中的催化机理，并提出了Na2SeO3与GSH通过氧化还原作用跨膜吸收Se的类生物膜模型。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　EG && G Model 273电化学系统（美国），铂电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，金盘电极和LCys Au/SAMs修饰电极为工作电极。 L半胱氨酸和Na2SeO3(Sigma公司)，实验用水为三次蒸馏水。

　　2.2 LCys Au/SAMs 修饰电极的制备[2]
　　
　　用金相砂纸将金电极表面磨光，依次用0.1和0.05 μm Al2O3粉末将金电极表面抛光，用水清洗后，放入Piranha溶液（V(30％h3O2)∶V(h3SO4)=1∶3）中浸泡15 min，然后分别用无水乙醇、蒸馏水超声清洗5 min，置于0.02 mol/L L半胱氨酸中，通氮除氧10 min后，在氮气氛中浸泡24 h 即得。

　　3 结果和讨论

　　3.1 Na2SeO3在裸金电极和LCys Au/SAMs 修饰电极上的电化学性质
　　
　　为比较LCys Au/SAMs 单分子膜及Na2SeO3在该单分子膜修饰电极上的电化学特性，在0.00～1.30 V（vs. SCE）电位范围内，分别考察了裸金电极和LCys Au/SAMs修饰电极在0.05mol/L h3SO4底液和含有一定浓度Na2SeO3溶液的该底液中的CV特性，结果见图１。在h3SO4底液中，裸金电极在1.15 V 处出现明显的金氧化电流(图１A)，在Epc=0.89 V处出现电极表面生成的金的氧化物的还原峰。当金电极表面修饰了L半胱氨酸单分子膜后(图１B)，除了上述金和金的氧化物的氧化、还原峰有明显增加之外，从0.83 V 开始先于金的氧化有明显的氧化电流，当电位负向扫描时，0.33 V 处有另外一个还原峰出现。电极修饰后的这两个额外的氧化还原电流是由于电极表面单分子膜(AuS)中的硫在外加电位的作用下， 氧化吸附和吸附物还原所致。LCys Au/SAMs 修饰电极在同样的条件下连续两次CV扫描，在第二圈扫描时，0.89 V处开始的氧化电流随扫描次数的增加而减小（图１B（2）），而峰电位在0.33 V的还原电流无明显变化。说明AuS的硫发生氧化作用后其产物可能没有以氧化脱附的形式离开电极表面来破坏单分子膜，而是以硫的氧化物的形式吸附并滞留在电极表面上，当电位还原扫描时这些吸附的氧化物重新还原产生Epc=0.33 V处的还原电流。据文献[9]，L半胱氨酸中的硫具有较活泼的氧化还原作用。因此，修饰电极上吸附在金电极上的硫在正电位下可在电极表面氧化成次磺酸、亚磺酸、磺酸等不同价态的衍生物，这种衍生物都具有较活泼的羟基，易在电极表面发生氧化吸脱附反应[1０]。本实验条件下，单分子膜上的硫在较正的电位下主要进行如下的氧化吸脱附反应：ＲＳ（ads）+h3ORSOH+H++e－ＲＳＯ（ads）＋Ｈ＋＋e－式中R表示半胱氨酸有机基团部分，RS(ads) 表示巯基在金电极表面生成的单分子膜。该反应中，单分子吸附层RS(ads)首先氧化脱附生成次磺酰化的半胱氨酸，然后氧化产物中的羟基在正电位下进一步氧化并吸附在金电极表面上。该氧化吸附反应导致图１B中始于0.89 V的氧化吸附电流的生成。当电位向负向扫描时，吸附物还原产生Epc=0.33 V处的还原电流。当修饰电极连续两次CV扫描时，单分子膜中的硫的氧化吸附电流明显减小，而还原电流无大的变化，说明次磺酰化的氧化产物在第一圈CV扫描时已牢牢吸附在电极表面。当溶液中含有10 μmol/L Na2SeO3时，裸金电极在峰电位1.03 V处观察到较负电位区沉积在金电极上的Se的阳极溶出峰（图１C）。Andrew等[11]指出，Se是在负电位驱动下以单分子膜的形式沉积在裸金电极表面上的。而在修饰电极上（图１D（1））， Se的溶出电流较裸金电极明显增加，而且峰电位负移0.04 V，说明修饰电极对Se的氧化溶出具有催化作用。当修饰电极第二圈CV扫描时（图１D(2)），0.99 V处的阳极溶出电流急剧减小，可能是由于单分子层的硫的氧化导致这种催化作用减小的缘故。

　　图１ 裸金电极(A，C) 和修饰电极(B，D) 分别在0.05 mol/L h3SO4溶液和含有10 μmol/L Na2SeO3的溶液中的CV图（略）

　　Fig.１ Cyclic voltammograms of naked (A，C) and modified electrode(B， D) in 0.05 mol/L h3SO4solutions containing 10 μmol/L Na2SeO3

　　电极在CV扫描之前在0.00 V (vs. SCE)处静置1 min（Electrode stand still at 0.00 V (vs. SCE) for 1 min bofore CV scan）。

　　3.2 还原电位对Se溶出峰电流的影响
　　
　　在0.0～1.30 V电位范围内（图１），裸金电极和修饰电极在CV扫描起始阶段较负电位区均可被还原电位驱动使Se还原成Se并沉积在电极表面上，又因修饰膜表面的硫（AuS）具有还原性，故修饰电极也可能在无还原电位驱动下通过AuS与Se发生氧化还原作用并沉积Se。为了探讨还原电位对Se的沉积的影响，渐次改变还原电位处起始电位记录了CV图并与裸金电极的结果进行了比较（见图２）。

　　图２ 修饰电极（A～C）和裸金电极（A′～C′）在含有10 μmol/L Na2SeO3 的0.05 mol/L h3SO4溶液在不同的起始电位时的 CV图（略）

　　Fig.２ Cyclic voltammograsm of modified electrode(A－C) and naked gold electrode(A′－C′) obtained with different initial potentials in the solutions of 0.05mol/L h3SO4 containing 10 μmol/L Na2SeO3

　　A，A′的起始电位(Ｉnitial potentials)： 0.2 V; B，B′的起始电位(Ｉnitial potentials)： 0.6 V; C，C′的起始电位(Ｉnitial potentials)： 0.8 V。

　　由图２可见，起始电位在0.2～0.8 V内，修饰电极在峰电位0.99 V处都能观察到Se的溶出峰（图3 A～C）；当起始电位大于0.6 V 时，裸金电极上未观察到Se的溶出峰。此结果说明，裸金电极上Se的沉积是还原电位驱动所致，而修饰电极即使无还原电位驱动也通过电极表面的S原子与Se作用生成Se。

　　3.3 LCys Au/SAMs 修饰电极上Se的沉积和催化溶出机理
　　
　　文献[12，13]指出：GSH的巯基在生物体内和体外均可与Se通过氧化还原作用经硒代过硫化物（GSSeSG）生成不稳定的硒代谷胱甘肽阴离子（GSSe－），该阴离子在质子作用下易歧化成Se和GSH。本实验发现，联接到LCys Au/SAMs 修饰电极表面上的S原子与Na2SeO3通过自发的氧化还原作用也能使Se还原成Se。根此可推测LCys Au/SAms 修饰电极上Na2SeO3还原成Se 的作用机理为图解１所示。
　　
　　图解1 单分子膜上的硫与亚硒酸作用生成纳米级的Se的机理（略）

　　Scheme 1 Mechanism of formation of elemental selenium by redox reaction between sulfur on monolayer and selenite

　　修饰电极与Se之间是通过 AuS界面上的S原子与Se的氧化还原反应传递电子的。Na2SeO3在溶液中与电极表面的S发生作用并与电极表面的S结合生成类似于硒代过硫化物中间产物。中间产物中的Se进一步还原成硒代半胱氨酸阴离子，阴离子是很不稳定的中间态物质，故易发生岐化反应生成Se并沉积在电极表面。这种反应在单分子膜修饰电极表面进行的可能性是存在的，因为金电极上的LCys单分子膜Se排列不紧密，存在具有很多空间的簇状结构[14]，Na2SeO3分子可充分渗透到单分子层到电极界面与S原子进行上述的电子交换反应。
　　
　　修饰电极上Se的溶出电流远大于裸金电极上的溶出电流（图１），且其氧化过电位也减小，说明Se在修饰电极上的阳极溶出过程可能具有催化性质，其可能的催化机理见图解２。当电位正向扫描时电极表面沉积的Se氧化成Se时， 单分子膜上的S原子在正电位下与Se发生氧化还原反应生成Se，而S原子则氧化成磺酸根并通过羟基吸附在电极表面上。这种作用产生Se的电极反应和化学反应平行的催化电流，导致Se溶出电流增加。

　　图解２ 修饰电极上硒的催化溶出电流的产生机理（略）

　　Sheme 2 Mechanism of catalytic stripping current for selenium

　　图解3 假设的通过细胞内的GSH 吸收硒的模式图（略）

　　Ｓcheme 3 Ｐostulated model of bioutilization of elemental selenium through GSH in the cell
　　
　　可以认为，细菌的‘红硒化’现象是由于GSH与Na2SeO3跨膜氧化还原作用生成Se引起的（菌类富含谷胱甘肽），是Na2SeO3通过Se来吸收外源性硒的重要的生化反应。这种吸收模式类似于在γ谷氨酰基循环过程中通过GSH的循环生化反应来跨膜吸收氨基酸至细胞内过程，GSH经若干步生化反应完成一次循环并把Se以Se的形式吸收至膜内(图解3)。

参考文献

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