反相高效液相色谱法测定蜂胶水提物中的酚类化合物

　　　　 作者：陈滨 罗丽萍 丽艳 徐元君 付宇新 高荫榆

【摘要】 建立了同时测定中国蜂胶水提物中23种酚类化合物的反相高效液相色谱（RPHPLC）分析方法。采用ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相：甲醇0.1%甲酸，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为256和280 nm，进样量20 μL，柱温35 ℃。各对照品质量浓度与色谱峰面积线性关系良好，具有较好的精确度和重现性，标准加入回收率在93.29%～106.61%之间。采用此法，从河北蜂胶中检测出18种对照品，其中表儿茶素含量最高35.50 mg/g WEP，其次是3，4二甲氨肉桂酸15.41 mg/g WEP。而云南蜂胶中检测到9种对照品，表儿茶素含量最高11.23 mg/g WEP，其次是白杨素3.61 mg/g WEP，两地蜂胶WEP的HPLC图相似度分别为0.099(256 nm) 和0.194(280 nm)，化学成分差异明显。

【关键词】 反相高效液相色谱法，蜂胶，水提物，酚类化合物

　　1 引言
　　
　　蜂胶（Propolis）是蜜蜂采集杨树等植物的新芽和受伤部位的渗出液，在口腔中加工转化而成的一种胶状物质。在低温时会变硬变脆，温度升高时会变软，并具有一定的粘性。蜂胶中含有300多种化学成分，其中包括芳香族和黄酮类、有机酸、萜烯类物质、维生素、酶类等[1]。蜂胶具有抗氧化、抗菌、消炎、抗病毒、保肝和抗癌等作用[2]。
　　
　　由于蜂胶的多数有效成分容易被醇提取，所以关于蜂胶醇提物的研究报道很多[3，4]，而蜂胶水提物（Water extraction of propolis， WEP）的报道较少，且多集于巴西蜂胶。巴西绿蜂胶（Green propolis）适宜用水提取[5]。WEP中含有大量的酚酸类化合物。Mishima等[6]采用HPLC从巴西WEP中检测出异樱花素、燕茜素、绿原酸、对香豆酸、阿替匹林、咖啡酰奎宁酸等物质。Matsui等[7]研究表明，巴西WEP比醇提物有更好的抗氧化作用，可以更好地抑制一些酶的活性[7]。Banskota等[8]发现巴西和中国WEP比醇提物具有更强的DPPH自由基清除能力，反之，秘鲁蜂胶和荷兰蜂胶是醇提物强于WEP。WEP对化学和免疫学肝损伤模型都有保肝作用，并具有抗血小板凝结、抗炎、保护视神经、免疫调节、抗肿瘤和抗菌等活性[9～11]。WEP还可以避免醇提液产生的副作用[12]，具有很好的应用前景。但目前尚未见关于中国WEP化学组成的研究报道。
　　
　　HPLC是分析WEP化学成分的主要方法。Mishima[6]和Orsolic[13]等分别对巴西等国蜂胶建立了HPLC方法，并测定了其WEP成分，但所用对照品较少。本研究选用了23种酚类化合物为对照品，通过对RPHPLC法的优化，建立了适合分离中国蜂胶WEP的方法，并考察了其重现性、检出限和加标回收率等参数。用本法测定了的两种中国蜂胶WEP的化学组成。本研究为全面了解中国蜂胶化学成分多样性提供了依据。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　美国Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括在线脱气装置，四元泵，柱温箱，光电二极管阵列检测器(DAD)，G2170BA LC化学工作站。
　　
　　肉桂酸、槲皮素、柚皮素、染料木素、山奈酚、芹菜素、p香豆酸、阿魏酸购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心（江西）； 没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、木犀草素、异鼠李素、桑黄素、黄芩素、α儿茶素、芦丁购自中国药品生物制品检定所（北京）； 杨梅酮、菲瑟酮、生松素、3，4二甲氧基肉桂酸、白杨素购自SigmaAldrich公司； 芦丁、杨梅酮、生松素（纯度≥95%），菲瑟酮、3，4二甲氧基肉桂酸、白杨素（纯度≥99%）； 其余对照品纯度≥98%。甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为超纯水。

　　2.2 标准溶液的配制
　　
　　分别称取各对照品5.0 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，终浓度为1.0 g/L，过0.45 μm滤膜后置于4 ℃冰箱中避光保存，作为储备液。其它对照品由储备液稀释得到。

　　2.3 样品溶液的配制
　　
　　原胶分别采自河北石家庄和云南西双版纳，简写为HB和YN。置于－18 ℃冷冻变硬变脆后，用木锤敲打砸成小碎块，用药材粉碎机粉碎后，于－18 ℃保存备用。
　　
　　对文献[14]的蜂胶水提取方法进行了改进。具体方法是：取4.0 g蜂胶，在120 mL蒸馏水中混匀，在60 ℃下水浴提取7 h。提取液离心30 min，收集上清液。残渣在同样条件下再提取1次。合并提取液，于60 ℃真空旋转蒸发仪浓缩，得到固态WEP； 用蒸馏水复溶，配制成10 g/L WEP溶液，经0.45 μm滤膜过滤后， 置于4 ℃冰箱中保存，待测。

　　2.4 色谱条件
　　
　　ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相为甲醇0.1 %甲酸，梯度洗脱条件见表1。流速1.0 mL/min； DAD检测波长为256和280 nm； 进样量20 μL； 柱温35 ℃。记录化合物在200～400 nm之间的吸收光谱。通过与对照品对比保留时间和UV吸收光谱确定化合物。

　　3 结果与讨论

　　3.1 色谱条件的确定

　　3.1.1 梯度洗脱条件确定 采用文献[6]的洗脱条件，考察甲醇水、乙腈水、甲醇0.1%甲酸3种流动相对23种对照品的分离情况。在35 ℃柱温下，以1.0 mL/min的流动相速度，对3种流动相进行选择。结果显示，甲醇水和乙腈水系统分离效果相近，甲醇0.1%甲酸可有效抑制酚羟基的解离，避免了酚类化合物的拖尾情况，使峰形对称，可以达到较好的分离效果。本实验选择甲醇0.1%甲酸作为流动相。
　　
　　采用文献[6]洗脱条件进行洗脱，对照品可较好分离。但由于WEP中含有大量极性物质，在该条件下分离不理想，有大量物质在前20 min不能完全分离，通过对洗脱时间及流动相比例进行调整，最终确定了梯度洗脱条件（见表1）。对照品和样品分离效果理想。

　　表1 梯度洗脱流动相比例（略）
　
　　Table 1 Ratio of mobile phases for gradient elution

　　3.1.2 检测波长选择 文献[6]选择280和325 nm测定了巴西WEP的化学成分。本实验将23种对照品制成0.02 g/L单标工作液，分别在200 ～400 nm波长范围内扫描，得到各对照品的紫外最大吸收峰，集中在5个波长250，256，280，311和360 nm。分别在上述5个波长，对混合对照品进行检测。结果表明，混合对照品在256和280 nm下的出峰数及分离效果较好。但在256 nm下有3个负峰出现，在280 nm波长下有8个负峰出现。综合考虑基线、峰形、信号响应强弱，以及负峰等情况，最终确定将对照品分为2组，分组后混合对照品的分离结果良好（图1）。

　　3.2 线性关系与检出限
　　
　　分别用甲醇将两组混合对照品溶液配制成不同浓度的混合对照品，在2.4的色谱条件下分别进样，每次进样20 μL，平行测定3次，以平均峰面积Y对进样量x（ng）进行线性回归，各物质的保留时间、线性范围、回归方程及相关系数等见表2。由表2可见，在一定样品浓度范围内，各对照品质量浓度与峰面积相关性良好。以信噪比(S/N）＝3确定各物质的检出限，结果见表2。

　　图1 256和280 nm波长下分组后的混合对照品色谱图（略）

　　Fig.1 Chromatograms of mixed 23 reference compounds after grouping under 256 nm and 280 nm

　　1. 没食子酸（Gallic acid）; 2. 儿茶素（Catechin）; 3. 表儿茶素（Epicatechin）; 4. 咖啡酸（Caffeic acid）; 5. α儿茶素（αCatechin）; 6. p香豆酸（pCoumaric）; 7. 阿魏酸（Ferulic acid）; 8. 芦丁（Rutin）; 9. 杨酶酮 （Myricetin）; 10. 3，4二甲氨基肉桂酸（3，4Dimethoxycinnamic acid）; 11. 菲瑟酮（Fisetin）; 12. 桑黄素（Morin）; 13. 肉桂酸（Cinnamic acid）; 14. 槲皮素（Quercetin）; 15. 柚皮素（Naringenin）; 16. 木犀草素（Luteolin）; 17. 染料木素（Genistein）; 18. 山奈酚（Keampferol）; 19. 芹菜素（Apigenin）; 20. 异鼠李素（Isorhamnetin）; 21. 黄芩素（Baicalin）; 22. 生松素（Pinocembrin）; 23. 白杨素(Chrysin）。

　　表2 混合对照品校正曲线、线性范围、检出限及加样回收率结果（略）

　　Table 2 Results of calibration curves， linear range， limit of detection and recovery of mixed reference compounds

　　3.3 精密度、稳定性和重复性实验
　　
　　新配制的两组混合对照品溶液，一天内重复进样6次。结果表明，色谱峰的个数和特征一致。各色谱峰峰面积的RSD在0.20%～2.11%之间，保留时间的RSD在0.06%～1.02%之间；混合对照品溶液配制好后，放在冰箱4 ℃下保存，每隔2 h测定一次，后每隔一天测定一次，连测4 d。各色谱峰峰面积的RSD在1.28%～4.33%之间，保留时间的RSD在0.31%～2.60%之间；以10 g/L WEP为检测对象，每6 h进样一次，共进样6次。主要的12个谱峰的色谱峰峰面积的RSD在1.10%～3.30%之间，保留时间的RSD在0.54%～3.20%之间。符合HPLC定量分析要求。

　　3.4 加标回收率实验
　　
　　准确称取1.0 g 河北蜂胶样品，分别加入0.5 mL混合对照品溶液，充分混匀，按2.3所述方法制备，在2.4节的色谱条件下分别以20 μL进样6次。测得回收率结果见表2。

　　3.5 样品分析
　　
　　在对照品种类、检测波长和洗脱条件等方面对文献[6，13]的方法进行了改进，并对对照品进行了分组，建立了可同时检查中国WEP中23种化学成分的RPHPLC方法。方法灵敏度高、准确性和重复性好，各对照品有良好的线性关系、精密度、稳定性和重复性。
　　
　　按照本方法，将HBWEP和YNWEP分别进样20 μL进行检测，结果见表3。从HBWEP中共检测出18种对照品，其中表儿茶素含量最高，达到35.50 mg/g WEP； 其次是３，４二甲氨基肉桂酸，含量是15.41 mg/g WEP；菲瑟酮、芦丁、槲皮素、异鼠李素和山奈酚未检测到；YNWEP中仅检测出9种对照品，表儿茶素含量最高，为11.23 mg/g WEP； 其次是白杨素，含量是3.61 mg/g WEP；槲皮素、芦丁、杨梅酮等14种对照品未检测到。HBWEP中可检测到的化合物明显多于YNWEP，除生松素和白杨素含量低于YNWEP以外，其它含量都明显高于YNWEP。两地WEP的色谱图有明显的区别，应用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 版）软件，评价其相似度仅分别为0.099（256 nm）和0.194（280 nm），说明这两地WEP的酚类化合物组成存在明显的差异。
　　
　　文献[6]测得巴西WEP中3，5二O咖啡酰奎宁酸、3，4二O咖啡酰奎宁酸、绿原酸、p香豆酸为主要成分，总量达183 mg/g。其中3，5二O咖啡酰奎宁酸含量最高，达到61 mg/g。本研究测得p香豆酸在HBWEP和YNWEP的含量分别为9.332和0.459 mg/g，明显低于巴西蜂胶的36 mg/g，而含量高的表儿茶素以及３，４二甲氨基肉桂酸、生松素等主要成分在巴西WEP中尚没有报道。
　　
　　蜂胶是一种纯天然物质，其化学组成受到地理位置、气候、季节、植被等生态因子影响[15，16]。蜂胶的物质组成基础来源于胶源植物，蜜蜂倾向于在它们首选的几种胶源植物采胶，所以蜂胶的成分取决于当地的植被分布[1７]。因此，不同气候带胶源植物的不同可能是造成两种蜂胶成分差异的主要原因。

　　表3 河北和云南蜂胶水提物的化学组成（略）

　　Table 3 Chemical compositions of water extraction of propolis from Hebei and Yunan

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