高效液相色谱电感耦合等离子体质谱联用技术测定干海产品中砷化学形态

　　　　 作者：高杨 曹煊 余晶晶 黎先春 王小如

【摘要】 利用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱联用技术研究了海带、羊栖菜、紫菜及浒苔等干海产品中的砷含量及其化学形态。实验表明，干海产品中主要砷形态为3种未知砷化物，对3种未知砷化物进行了表征。采用高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术对羊栖菜和海带中的3种未知砷化物的分子量，分别为329.0599， 483.0738和409.0162，通过对比，确定这3个未知峰分别为3种砷糖类物质: DMAglycerol ribose， DMAphosphate ribose和DMAsulfate ribose。对样品中砷的定量分析结果显示，干海产品中砷总量虽然超出我国国标中关于海产品中砷限量标准规定的20倍以上，但大多数植物性干海产品中主要的砷形态为毒性较低的砷糖类物质DMAsulfate ribose（U4），其含量约占可提取砷量的51.1%～80.3%，海带中的砷主要以DMAphosphate ribose（U3）的形式存在，占总可提取砷的48.9%。

【关键词】 高效液相色谱，电感耦合等离子体质谱，飞行时间质谱，砷形态，干海产品，砷糖

　　1 引言
　　
　　海鲜和干海产品中相对较高的有毒元素砷含量危害着食用者的健康[1～3]。海产品中现已发现的自然砷化物有 25 种之多，而各种砷化物的毒副作用与其形态密切相关[4，5]。其中，无机砷（包括As和As）的毒性最强，有机形态的一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）等毒性较小，而海洋生物体内存在的砷甜菜碱（AsB）和砷胆碱（AsC）被认为是无毒的[6]。以砷化合物的半致死量LD50计，其毒性依次为H3As＞As＞AsV＞MMA＞DMA＞TMAO（三甲基砷氧化物）&> 砷糖＞AsC&> AsB[7～9]，基于这种情况，砷的毒性研究应当从砷的形态分析入手，区分海产品中的无机砷和有机砷化物，特别是无毒的砷甜菜碱、砷胆碱、砷糖类物质对于海产品的安全评价非常重要。以砷化物的不同形态对海产品安全进行综合评价，比用砷的总量评价更具科学性。但从目前的研究来看，绝大多数的研究集中于新鲜海产品中砷形态分析，对干海产品的研究尚处于空白状态。干海产品加工过程中的处理工艺会对海产品中的砷存在形态造成影响[10]。本研究在前期工作的基础上［11］， 采用HPLCＩＣＰＭＳ联用方法，研究以海带、羊栖菜、紫菜、浒苔的干海产品为研究对象，对其中砷的存在形态进行分析。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　7500a型电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS，美国Agilent公司）；HPLC1100型高效液相色谱；G1969A型电喷雾飞行时间质谱仪；Hamilton PRPX100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；Freezone冻干系统（美国Labconco公司）； EYELA旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)； Z383K型离心机(德国Hermle公司)； ASE100型快速溶剂萃取仪（Dionex 公司）。
　　
　　丙酮、甲醇、HCl、HNO3（65%）和h3O2（30%）均购于德国Merck公司；砷标准物质AsI3、As2O5购自美国Alfa Aesar公司；二甲基胂酸(DMA)购于美国Acros Organics公司；砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、甲基胂酸(MMA)由清华大学提供。所有储备液于4 ℃冷藏避光保存，混合标准溶液由以上标准品制得，包含所有砷形态。超纯水由Millipore纯水系统制得。

　　2.2 仪器的工作参数及优化
　　
　　用10 μg/L 7Li，89Y，140Ce，205Tl调谐液优化ICPMS参数，再用约含1 mg/L Li，Sc，Ge，Y，In，Te，Bi的混合溶液对ICPMS的工作条件进一步优化。完成上述优化后，用50 μg/L As溶液(2％ HNO3介质)调节As的灵敏度。优化后的ICPMS的工作参数：射频功率：1350 W；射频匹配电压：1.6 V；载气：1.10 L/min；辅助气：0.2 L/min；Babington雾化器，玻璃双路雾化室和标准石英炬；雾化室温度：－5 ℃；选择气：40% O2。色谱柱：Hamilton PRPX100（250 mm×4.1 mm，10 μm），流速：1.5 mL/min；进样量：25 μL。采用聚四氟乙烯管（0. 17 mm i.d.）连接ICPMS的Babington雾化器与色谱柱。由于35Cl和仪器所用的高纯载气（氩气）易形成75ClAr＋，干扰75As检测，因此，采用时间分辨分析模式，同时监测75As，72Ge，35Cl，77Se，83Kr的信号，用以排除75ClAr＋干扰峰[12]。
　　
　　高分辨飞行时间质谱的工作参数：电喷雾质谱为正离子模式，扫描范围m/z 75～500；毛细管电压：4000 V；喷雾气压：34.5 kPa；干燥气流速（N2）：11.0 L/min；气体温度：330 ℃；裂解电压：100 V；参比溶液：m/z 121.0509，922.0098；分辨率：9500±500（922.0098）。

　　2.3 样品和样品前处理
　　
　　实验样品购自青岛大型超市。样品清洗干净后冷冻干燥至恒重。粉碎，过2 mm孔径筛后封装， 储存于冰箱备用。
　　
　　取备用干海产品0.2 g于聚四氟乙烯瓶中，加入5 mL浓HNO3，10 min后密封并于80 ℃烘烤4 h，然后冷却，释放瓶中气体。然后继续于170 ℃下烘烤4 h，待冷却后，给瓶中加入1 mL h3O2，并用去离子水稀释并定重至25 g，用ICPMS测定总砷。
　　
　　干海产品中砷的提取：在4种常用的提取方法中选用提取效率较高的快速溶剂提取法[1３]，提取效率比较见表1。准确称取0.2 g粉碎后的样品放入萃取池中，在室温、10.3 MPa压力条件下，用50％甲醇溶液（V/V）萃取5 min，最后氮气吹扫60 s。此过程重复3次，提取结束后合并提取液并用快速漩流浓缩仪在65 ℃条件下浓缩。用超纯水稀释浓缩液并定重至25.0 g，得待测样品溶液。

　　3 结果与讨论

　　3.1 干海产品中总砷测定
　　
　　测得实验样品的总砷（AsT）含量如表1所示。与我国国标海产品中砷限量标准规定海产品中的砷总量不得超过2.0 mg/kg相比，本研究的海产品均超出了20倍以上。如果以这种标准加以衡量，大多数干海产品均不可食用。但事实上，因食用海产品导致急性或慢性中毒的案例极少，这说明以总砷（AsT）含量作为评价干海产品毒性的标准不准确。因而对干海产品中砷形态的研究十分必要。

　　表1 样品中总砷含量及不同提取组分中的砷含量（略）

　　Table 1 Total arsenic（AsT） concentration in samples by acid digestion and extractions

　　a. 平均值±标准偏差（Precision is expressed as ±one standard deviation）； b. 酸消解总砷含量（Total arsenic concentration were considered as acid digestion arsenic）； c. EE%为总可提取砷占酸消解砷总量的百分比（Extraction efficiency (EE) is defined as the percentage of total acid digestion arsenic）； d. 不同提取方法得到的总可提取砷含量（Total arsenic was the sum of those three extractions）。
　　
　　3.2 干海产品中砷形态分析
　　
　　采用Hamilton PRPX100阴离子色谱柱对6个砷标准品及提取的干海产品砷形态进行分析，结果见图1。由图1可知，干海产品中的砷形态复杂，根据实验室已有标准物质仅能辨识出谱图中As，As以及MMA，且在研究的干海产品中仅以次要组分形式存在，未检出AsB。对于干海产品中的主要砷形态，其保留时间均与已有的砷形态标准物质的保留时间不符，无法直接表征，对应的保留时间分别为U1(tr=53.6 s)，U2(tr=102.4 s)， U3(tr=336.4 s)以及U4(tr=661.4 s)。

　　图1 干海产品中砷形态的HPLCICPMS谱图（略）

　　Fig.1 HPLCICPMS chromatograms of botanic dry seafood products

　　1. 浒苔（ Enteromorpha prolifera）； 2. 海带（Kelp）； 3. 紫菜（Laver）； 4. 羊栖菜（Sargassum fusiform）。

　　3.3 未知砷化物的表征
　　
　　Almela等[1４]采用与本研究相近的色谱法研究了大型褐藻海带中砷形态分布，并从中确定出4种五价二甲基砷糖类化合物。通过对比发现，本实验得到的3个未知峰（U2，U3，U4）与文献[1４]报道的3种砷糖（DMAglycerol ribose，DMAphosphate ribose和DMAsulfate ribose）的出峰相对位置以及峰形非常接近。为了证明图1中未知的3种砷化物就是以上3种砷糖，采用高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术对羊栖菜和海带中的未知砷化物的精确分子量进行测定，测定结果见图2和图3。由图2b可知，与DMAglycerol ribose加[M+H]＋ 的分子量（329.0581）相当接近，质量偏差为+5.5×10－6。图2c中给出了U4的分子离子峰的质谱谱图，未知砷化物U4分子离子峰的分子量为409.0162，与DMAsulfate ribose的[M+H]＋的分子量409.0150非常接近，质量偏差为+2.9×10－6。对应于未知峰U2，TOFMS给出的分子离子峰的精确分子量为329.0599，在海带样品中对U3峰进行表征，见图3b。通过测定发现对应于海带样品中U3出峰位置的分子离子峰分子量为483.0738，与DMAphosphate ribose的分子量非常接近，质量偏差为+2.6×10－6。因此确定U2，U3和U4分别为DMAglycerol ribose， DMAphosphate ribose 和 DMAsulfate ribose。由于U1含量较低，因而在研究中未对其进行讨论。

　　图2 羊栖菜中砷形态的HPLCICPMS质谱图(a)、干海产品中未知峰U2(b)和未知峰U4(c)的质谱图（略）

　　Fig.2 Spectra of As speciation analysis of Sargassum fusiform extract by HPLCICPMS(a)， mass spectra of unknown arsenicals of U2(b) and U4 (c) in Sargassum fusiform analyzed by HPLCTOFMS

　　图3 海带中砷形态的HPLCICPMS谱图(a)和未知峰U3(b)的质谱图（略）

　　Fig.3 Spectra of As speciation analysis of Kelp extract by HPLCICPMS(a) and mass spectra of U3 in Kelp analyzed by HPLCTOFMS(b)

　　3.4 干海产样品中砷形态定量分析
　　
　　由于仅获得6种砷形态标准，因而仅对干海产品中这6种砷形态进行定量分析。由表3形态分析结果（未检出AsC， AsB）可知，植物性海产品中，砷的主要存在形态是砷糖类物质。目前没有商业化的砷糖类物质标准，无法对其含量进行准确定量分析，基于此，采用半定量方法，通过计算砷糖类物质与所有砷形态的ICPMS谱图峰面积的比值大体反映砷糖类物质在干海产品中所占的比例，结果见表4。结果表明，大多数植物性干海产品中主要的砷形态为DMAsulfate ribose（U4），含量约占可提取砷量的51.1%～80.3%，海带中的砷主要以DMAphosphate ribose（U3）形式存在，占总可提取砷的48.9%。综上可知，在研究的干海产品中3种砷糖约占总可提取砷量的63.5%～92.7%，是植物性干海产品中最主要的砷形态。

　　表3 干海产品中砷形态分析结果（略）

　　Table 3 Speciation of arsenic compound in samples

　　a不同砷形态占总可提取砷的百分比（PE% is defined as percentage of total extractable arsenic）； b ND 表示为未检测出（ND presented not detected）。

　　表4 干海产品中砷糖的峰面积（略）

　　Table 4 Peak area of arsenosugars in marine plants DSPs

　　a PA%为不同砷形态的峰面积占总砷形态峰面积之和的百分比（PA% is defined as percentage of total arsenic peak area）；b ND 表示未检测出（ND presented not detected）。

　　4 结论
　　
　　对海带、羊栖菜、紫菜、浒苔的干海产品中砷形态分别进行了分析。快速溶剂提取法操作简单，提取效率高（77%～85%），可用于干海产品中砷的提取。通过HPLCICPMS和HPLCTOFMS技术对干海产品中的砷存在形态进行了分析。结果表明，干海产品中的砷主要以毒性较低的砷糖类物质存在，约占总可提取砷量的63.5%～92.7%，食用安全 。此外，对植物性干海产品中的部分砷糖类物质进行表征，发现了3种五价的二甲基砷糖类物质，分别为DMAglycerol ribose， DMAphosphate ribose 以及 DMAsulfate ribose。

参考文献

　　１ Andreae M O. Limnology. Oceanography， 1979， 24: 440～452

　　２ Andreae M O. Deep Sea Research， 2005， 25(4): 391～402

　　３ Francesconi K A， Edmonds J S. In: Nriagu， J.O. (Ed.)． Arsenic In The Environment. Part Ⅰ， New York: Cycling and Characterization John Wiley， 1994: 221～261

　　４ Penrose W R. Analysis， Ｏccurrence， and Ｓignificance， CRC Critical Reviews in Environmental Control， 1974， 4: 465～482

　　５ Andreae M O. In: Craig， P. J. (Ed.)． Organoarsenic Compound in Environment， Principles and Reactions， New York: Wiley， 1986: 198～228

　　６ Brown J L， Kitchin K T， George M. Teratog Carcinog Mutagen， 1997， 17(2):71～84

　　７ Whitacre R W， Pearse C S. Mineral Industries Bulletin， Colorado， School of Mines， 1972: 1～2

　　８ Hindmarsh J T， McCurdy R F. CRC Ｃritical Ｒeviews in Ｃlinical Ｌaboratory Ｓciences， 1986， 23(4): 315～347

　　９ Vega L， Styblo M， Patterson R， Cullen W， Wang C， Germolec D. Toxicology and Applied Pharmacology， 2002， 172(3): 225～232

　　１０ Devesa V， Velez D， Montoro R. Food and Chemical Toxicology， 2008， 46(1): 1～8

　　１１ Wang Geng(王 庚)， Jing Miao(荆 淼)， Cao Xuan(曹 煊)， Hao ChunLi(郝春莉)， Yang HuangHao(杨黄浩)， Yang GuoSheng（杨国生)， Wang XiaoRu(王小如). Chinese J. Aanl. Chem.(分析化学)， 2008， 36(9): 1182～1186

　　12 Se′bastien N， Ronkart， Vincent Laurent， Philippe Carbonnelle. Chemosphere， 2007， 66(4): 738～745

　　１３ Francesconi K A， Kuehnelt D. Analyst， 2004， 129(5): 373～395

　　１４ Almela C， Laparra J M， Velez D， Barbera R， Farre R， Monotoro R. Journal of Agriculture and Food Chemistry， 2005， 53(18): 7344～7351