固相萃取高效液相色谱荧光检测土壤中喹诺酮类抗生素

　　　　作者：邰义萍 莫测辉 李彦文 包艳萍 张艳 姚圆 罗晓栋

【摘要】 建立了固相萃取高效液相色谱荧光(HPLCFLD)检测土壤中4种喹诺酮类抗生素的分析方法。样品采用50% Mg(NO3)210% NH3·h3O（96∶4，V/V）超声提取，过HLB柱富集净化，再用乙腈0.067 mol/L H3PO4溶液洗脱。采用高效液相色谱荧光检测器，以乙腈0.067 mol/L H3PO4(用三乙胺调节至pH 2.5)为流动相，于激发波长280 nm、发射波长450 nm处进行检测。土壤样品中4种喹诺酮类抗生素的加标回收率在60.4%～99.3%之间，检出限为0.58～1.0 μg/kg。对蔬菜基地土壤样品分析结果表明，本方法能够满足实际样品的分析要求，4种喹诺酮类抗生素均被检出，土壤中抗生素污染问题值得关注。

【关键词】 土壤， 喹诺酮类抗生素， 固相萃取， 高效液相色谱， 荧光检测

　　1 引言
　　
　　喹诺酮类抗生素(QNs)大量用于人类和动物医疗，还添加于饲料中以提高饲料利用率和促进动物生长[1，2]。抗生素摄入后大部分（&>85%）以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外[1]，成为新的环境污染物，并以多种途径进入土壤。其中人用抗生素在城市污水中的浓度高达10－５ g/L[3]，在污水处理过程中其去除率通常较低[4]，导致大量抗生素进入地表水，造成河流抗生素污染[5]，并通过灌溉水进入农业土壤[6]。规模化养殖场畜禽废物（粪尿）中抗生素的浓度高达0.01～0.1 g/kg水平[7]，并作为有机肥广泛用于农业生产，每年由此输入土壤中抗生素的数量甚至不亚于农药，从而导致土壤抗生素污染，并引发水体污染，产生耐药性，危及生态安全和人体健康[8，９]。
　　
　　近年来，喹诺酮类抗生素在水体、土壤和畜禽废物中被普遍检出[９，10]，但在环境中主要以痕量存在，在水体中含量通常为10－8g/L水平[1１]，在养殖场附近底泥中含量可达10－4g/kg水平[１２]。目前，主要采用液相色谱质谱联用(HPLCMS)分析环境中喹诺酮类抗生素[９，1０，１３]。因仪器昂贵而难以普及，且主要是针对水体进行分析。虽然肉奶蛋等动物性食品中抗生素残留的高效液相色谱分析方法已成熟且有相关标准，但由于土壤与动物性食品间的性质差异很大，且土壤中杂质更为复杂。因此，不能直接采用食品中的提取净化方法来分析土壤中的抗生素。目前，利用高效液相色谱仪分析土壤中喹诺酮类抗生素的报道很少，检测的化合物种类少[１４]，或是以灵敏度欠佳的紫外光来进行检测[１５]。为此，本研究建立了有效价廉的高效液相色谱荧光同时测定土壤中4种喹诺酮类抗生素的分析方法。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂
　　
　　高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SHZ82恒温震荡器；KQ250E超声波清洗器；24管固相萃取装置；HLB固相萃取柱(3 mL， 60 mg），Supelco公司)；C18固相萃取柱(3 mL， 500 mg），Supelco公司)；雷磁PHS3C精密pH计；氮吹仪。
　　
　　4种喹诺酮类抗生素：诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)和恩诺沙星(ENR)，（纯度＞98.0%，德国Ｄr. Ehrenstorfer公司）。甲醇和乙腈（色谱纯，Sigma公司）；其余试剂均为分析纯；实验用水为高纯水。
　　
　　标准品母液：准确称取4种喹诺酮类抗生素标准品各0.0100 g， 溶入0.05 mol/L NaOH溶液，并用高纯水稀释定容至100 mL，配制成浓度为100 mg/L的工作母液，在4 ℃下避光保存。50% Mg(NO3)2溶液：称取50g Mg(NO3)2·6h3O溶于100 mL高纯水，室温保存。10% NH3·h3O将２５％的氨水用水稀释１０部，现配现用。0.067 mol/L H3PO4/三乙胺溶液(pH 2.5)：取5 mL H3PO4，加高纯水稀释至1000 mL，滴加三乙胺调pH至2.5。
2.2 样品预处理
　　称取1.00 g粉碎后风干过0.30 mm孔径筛的土壤样品于10 mL离心管中，加入50%Mg(NO3)210% NH3·h3O（96∶4， V/V） 5 mL，振荡5 min，超声提取15 min，离心（4500 r/min）5 min，收集上清液。残渣再用上述方法反复提取2次。合并提取液，过HLB固相萃取小柱（小柱先后用6 mL甲醇、6 mL水进行预处理）萃取富集。用6 mL高纯水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL乙腈H3PO4溶液(5∶1， V/V)洗脱小柱。洗脱液在40 ℃水浴下用氮气吹至近干，用流动相定容至1 mL，溶液过0.22 μm膜，收集滤液于样品瓶中待测。
　　
　　2.3 色谱条件
　　
　　Waters色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；激发波长280 nm，发射波长450 nm；柱温25 ℃；进样量 20 μL；流动相：乙腈0.067 mol/L H3PO4溶液(15∶85，V/V)； 流速：1.0 mL/min。

　　3 结果与讨论

　　3.1 色谱条件的确定
　　
　　喹诺酮类抗生素能够产生荧光，可采用荧光检测器进行定量分析。结合其最大吸收波长，实验确定了激发波长为280 nm，发射波长为450 nm。喹诺酮类抗生素结构中游离羧基及碱性氮原子的解离会造成色谱峰拖尾严重和保留值不稳定等问题[1６]。因此，采用H3PO4溶液作为离子抑制剂，加入三乙胺（调节pH 2.5）以消除出峰脱尾现象。实验确定了乙腈0.067 mol/L H3PO4(15∶85， V/V) 溶液为流动相，可获得4种喹诺酮类抗生素标准溶液理想的色谱分离图标样（0.5 mol/L）、土壤和加标土壤中4种喹诺酮类抗生素的色谱分离图见图1，且出峰时间较短(图2b)。

　　图1 4种喹诺酮类抗生素的HPLC分离图（略）

　　Fig.1 Chromatograms for the separation of four quinolone antibiotics（QNs）

　　a. 0.5 mg/L标样（Ｓtandards solution）； b. 土壤（Ｓoil sample）; c. 加标土壤（Ｓpiked soil sample，0.5 mg/L)。1. 诺氟沙星(Norfloxacin， NOR)； 2. 环丙沙星(Ciprofloxacin， CIP)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin， LOM)； 4. 恩诺沙星(Enrofloxacin， ENR).

　　3.2 提取条件的优化

　　3.2.1 提取液的筛选 喹诺酮类抗生素的极性结构决定了其可溶于有机溶剂和碱性水溶液，且弱碱性时能与Mg2+形成稳定的螯合物[１７]。因此，选取两种极性有机溶剂的碱性溶液10%乙腈NH3·h3O和10%丙酮NH3·h3O，以及50% Mg(NO3)2溶液和50% Mg(NO3)22% NH3·h3O(96∶4， V/V)4种提取液各5 mL，分别对1.00 g加标（0.5 μg/g）土壤样品中4种喹诺酮类抗生素进行超声提取（30 min），获得4种喹诺酮类抗生素的回收率见图3。可以看出，50% Mg(NO3)22% NH3·h3O（96∶4，V/V）对土壤中4种喹诺酮类抗生素的提取效果均较理想（58.7%～79.1%）。实验进一步考察该提取液添加不同浓度NH3·h3O对提取效果的影响（图4），可以看出，NH3·h3O浓度为10%时4种喹诺酮类抗生素的回收率达69.2%～82.0%。因此，选择50% Mg(NO3)210% NH3·h3O（96∶4，V/V）作为提取液。

　　3.２.2 提取液用量的确定 提取液用量会影响喹诺酮类抗生素的提取效果。用量太少造成提取不完全；太多则会提取更多杂质。当提取液用量为4 mL时，4种喹诺酮类抗生素的回收率均在70%以上（70.2%～85.0%），高于2 mL（62.6%～77.9%）， 3 mL（61.8%～67.8%）和5 mL（69.4%～80.1%）的回收率。因此，选择1 g土壤样品用4 mL提取液进行提取。

　　图2 流动相中H3PO4溶液不同配比对喹诺酮类抗生素出峰的影响（略）

　　Fig.2 Effect of mobile phase with different volume of phosphoric acid on separation of quinolone antibiotics

　　a. 乙腈(Ａcetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=17∶83， V/V； b. 乙腈(Ａcetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=15∶85， V/V； c. 乙腈(Ａcetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=13∶87， V/V。 1. 诺氟沙星(Norfloxacin)； 2. 环丙沙星(Ciprofloxacin)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin)； 4. 恩诺沙星(Enrofloxacin)。

　　图3 不同提取液对喹诺酮类抗生素的回收率（略）

　　Fig.3 Recovery of quinolone antibiotics in soil with various extractions

　　10%乙腈(Acetonitrile)NH3·h3O； 10%丙酮(Acetone)NH3·h3O； 50% Mg(NO3)2； 50% Mg(NO3)22% NH3·h3O(96∶4， V/V)

　　图4 提取液中添加不同浓度NH3·h3O对回收率的影响（略）

　　Fig.4 Effect of various concentrations of ammonia added to extraction on recovery of quinolone antibiotics

　　3.２.3 超声提取时间的选择 不同超声提取时间对喹诺酮类抗生素的回收率也有较大影响。

　　图5 超声提取时间对喹诺酮类抗生素回收率的影响（略）

　　Fig.5 Effect of ultrasonicextraction time on recovery of quinolones

　　图5是不同超声提取时间对土壤中4种喹诺酮类抗生素的提取效果。超声提取时间为15 min时，4种喹诺酮类抗生素的回收率均最高。

　　3.３ 不同萃取方式对回收率的影响
　　
　　比较了液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）对喹诺酮类抗生素的富集效果。LLE采用三氯甲烷为萃取液，SPE选用两种固相萃取小柱HLB和C18，其回收率见表1。三氯甲烷液相萃取和C18固相萃取对4种喹诺酮类抗生素的回收率均不佳。HLB柱固相萃取对4种QNs的回收率较高，且操作过程简便，能够避免萃取过程中出现干涸。因此，选择HLB固相萃取小柱对土壤样品进行预处理。

　　3.4 不同洗脱液及其用量的选择
　　
　　实验比较了甲醇、乙腈以及乙腈0.067 mol/L H3PO4作为洗脱液的回收率。结果表明，不同洗脱液的回收率依次为： 乙腈0.067 mol/L H3PO4（5∶1， V/V）&>甲醇&>乙腈。分5次洗脱，每次1 mL，分段收集洗脱剂测定回收率，乙腈H3PO4体系的淋洗曲线如图6。由图6可见，第3次洗脱回收率已基本稳定，因此选择洗脱液用量为3 mL。

　　图6 洗脱液不同用量对回收率的影响（略）

　　Fig.6 Recovery of QNs using different dosage of elution solution

　　表1 不同萃取方式对喹诺酮类抗生素的回收率（略）

　　Table 1 Recovery of quinolones treated with different extraction method

　　3.５ 线性范围、检出限、回收率和精密度
　　
　　将标准品母液用高纯水稀释成0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20和0.50 mg/L的混合标准工作液。在上述色谱条件下进样，得到4种喹诺酮类抗生素浓度（y）与峰面积（x）的线性关系，相关系数r&>0.99。以10倍信噪比求得4种喹诺酮类抗生素的仪器检出限和土壤样品定量限（表2），比文献[１4，１6]报道的低1～2个数量级。
　　
　　在土壤样品中添加不同浓度的喹诺酮类抗生素混合标准溶液，进行加标回收实验，获得回收率及相对标准偏差，结果见表3。为进一步确认方法的可靠性，在1.00 g土壤中添加喹诺酮类抗生素（0.5 mg/L）进行不同批次各3个重复的预处理与分析，批间平均回收率在67.7%～92.3%之间； 批内标准偏差低于3%； 批间标准偏差低于5%（表4），表明本方法的准确度和精密度均符合样品分析要求。

　　表2 四种喹诺酮的线性关系、相关系数和检出限（略）

　　Table 2 Regression analysis of calibration curves and quantification limits for 4 quinolone antibiotics

　　表3 土壤中4种喹诺酮的加标回收率(%)及相对标准偏差（略）

　　Table 3 Recovery and RSD（%）of 4 quinolone antibiotics in soil(n=3)

　　表4 不同批次分析加标(0.5 μg/g)土壤中回收率(%)及相对标准偏差（略）

　　Table 4 Recovery and RSD（%）of 4 quinolone antibiotics in soil of three batches(n=3)

　　3.６ 土壤样品的测定
　　
　　利用上述所建立的分析方法，对广州市某蔬菜基地6个土壤样品中4种喹诺酮类抗生素进行了分析。结果表明，土壤样品中均检出4种喹诺酮类抗生素，总含量在27.8～129.3 μg/kg之间。其中诺氟沙星为14.9～64.4 μg/kg， 环丙沙星为54.67～31.5 μg/kg， 恩诺沙星为5.13～40.2 μg/kg， 洛美沙星为0.87～6.84 μg/kg。环丙沙星的含量明显低于直接用畜禽排泄物施肥或用污水灌溉的土壤[１６，１７]。

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