阵列叉指式芯片研究细胞介电电泳富集过程

　　　　 作者：郝敦玲 徐溢 曾雪 曹强 温志渝

【摘要】 采用阵列叉指电极介电电泳(Dielectrophoresis，DEP)芯片，构建了集成DEP芯片分析和操控系统，应用Coventorware有限元分析软件模拟分析了芯片表面的电场分布情况;以红细胞和结肠癌细胞样品为分析对象，实现了两种细胞样品在芯片上的正负介电电泳定位富集。实验发现，交流信号幅值Vpp是决定DEP富集效率的主因，交流信号频率f和缓冲溶液是改变细胞介电电泳类型的参量;在0.9% NaCl中，施加频率为10和3 MHz、电压5 V的交流频率，结肠癌细胞的正介电电泳(Positivedielectrophoresis， pDEP)和负介电电泳(Nagetivedielectrophoresis， nDEP)富集效率分别为87.2%和84.8%。

【关键词】 芯片介电电泳，细胞富集，阵列叉指电极

　1 引 言

　　芯片介电电泳(Microchip dielectrophoresis)是以介电电泳分离原理和微机电加工技术为基础的新型分析技术，在生化样品分析方面明显优于常规检测方法。近年来，芯片介电电泳已从最初的对中性粒子的简单富集操作，扩展到对细菌、细胞、病毒、纳米材料和金属颗粒等物质的富集、分离和操控等方面[1～4]。介电电泳(Dielectrophoresis，DEP)与流体力[5]、电场力[6]、激光镊子[7]等模式耦合的研究已有报道，同时将芯片介电电泳技术与其它分析方法耦合也是新的研究方向。芯片介电电泳分析系统的微电极结构是决定其分析性能的关键，因此设计出分离性能更高、结构更合理的微电极备受关注。近年来，DEP芯片电极构型已由传统的平面式电极发展为三维式电极，出现了夹板式电极、笼式电极和绝缘柱式电极等多种结构[8，9]。本研究以阵列叉指电极式DEP芯片为核心单元构建DEP芯片分析系统，在对叉指电极表面的电场分布情况和介电电泳力作用范围进行计算模拟的基础上，以红细胞和结肠癌细胞为研究对象，应用构建的DEP芯片分析系统对细胞样品的介电电泳富集过程进行系统研究，以期为快速高效检测复杂体系中细胞样品奠定理论和技术基础。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Agilent 33220A型任意函数信号发生器(安捷仑公司); IX71奥林巴斯荧光倒置显微镜(日本Olympus公司); Alpha Innotech型微泵(美国Alpha公司); Qcapture pro.图像采集处理软件， Camtasia Studio屏幕录制软件。

　　Sylgard184有机硅弹性体即聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane， PDMS;美国道康宁公司)，用于浇注PDMS盖片。缓冲液配制： 分别精确称取4.000 g NaCl， 0.100 g KCl， 1.744 g Na2HPO4·12h3O和0.100 g Kh3PO4， 溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成磷酸盐缓冲液(PBS)。抗凝剂配制：称取EDTA2Na 4.0 g溶解定容于100 mL容量瓶中。0.9%NaCl医用生理盐。以上试剂均用0.22 μm高温灭菌后的微孔滤膜过滤后备用。样品：红细胞(red blood cell， RBC)形状呈双面凹陷的圆盘状，直径约7.5 μm;116型结肠癌细胞(colon cancer cell)呈圆球形，直径约15 μm。所有细胞样品均由重庆第三军医大西南医院临床检验科提供。

　　2.2 实验步骤

　　2.2.1 阵列叉指电极DEP芯片制作及分析系统搭建 DEP芯片的底片为键合有Au电极的玻璃片，阵列叉指电极宽度和间距均为30 μm，玻璃底片尺寸为25 mm×17 mm×2 mm，由中国科学院大连化学物理研究所外协制作。采用PDMS制作DEP芯片的盖片。将PDMS预聚体和固化剂按质量比10:1混合均匀，浇注于硅烷化处理后的SU8管道阳膜上，脱气后于60 ℃恒温干燥箱中固化4 h，室温冷却后小心剥离PDMS盖片，用孔径为3 mm的打孔器在PDMS盖片上打孔备用，形成的微管道宽150 μm，深30 μm，长10 mm。将带有微管道的PDMS盖片依次用乙醇、二次蒸馏水、乙醇清洗后风干备用。键合Au电极的玻璃底片用丙酮轻轻擦洗并风干，备用。最后将玻璃底片与PDMS盖片密合，抽负压吹干，即完成阵列叉指电极式DEP复合式结构芯片的制作，芯片实物和电极构型如图1所示，芯片分析系统构建如图2所示。

　　a. 进样口(Inlet); b. 废液池(Outlet); c. 注射微泵(Injection micropump); d. 注射器(Injection syring); e. 信号发生器(Signal generator); f. 示波器(Digital oscilloscope); g. 电源控制器(Power controller). 分 析 化 学第37卷第9期郝敦玲等：阵列叉指式芯片研究细胞介电电泳富集过程 2.2.2 影响细胞DEP富集的因素 (1)缓冲介质固定交流信号幅值Vpp为5 V，在不同频率f下，考察红细胞在PBS和0.9%NaCl两种缓冲溶液中的介电电泳富集过程; (2)交流信号幅值Vpp 选择0.9%NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号频率为10 MHz，考察Vpp在1～10 V范围逐步变化时，红细胞和结肠癌细胞的富集过程; (3)频率f 选择0.9%NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号幅值Vpp为5 V，考察f在1～20 MHz范围逐步变化时，红细胞和结肠癌细胞的富集过程。

　　2.2.3 结肠癌细胞介电电泳富集 以116型结肠癌细胞作为分析对象，缓冲溶液选用0.9% NaCl，细胞浓度为103～104 cell/mL，Vpp=5 V，分别在10 MHz和3 MHz条件下，对结肠癌细胞进行DEP富集实验。

　　3 结果与讨论

　　3.1 阵列叉指电极式DEP芯片上电场分布模拟

　　依据芯片介电电泳原理，通过有限元方法数字化程序，在建立合适的二维模型基础之上，模拟不同的几何结构电极的电场分布，在给定的边界条件和参数下，预测电场梯度的变化。这不仅有利于确定最优的电极结构，还能确定介电电泳的有效作用区域[10]。

　　本实验采用Coventorware有限元分析软件对DEP芯片管道内的电场分布进行了模拟。在2 V 1 MHz的交流信号下，电极宽度和间距与芯片实际尺寸相同均为30 μm，阵列叉指电极表面不同高度处的E分布情况如图3所示。当叉指电极宽度和间距为30 μm时，电极表面电场梯度分布差异明显，电场梯度最大的位置出现在叉指电极的边缘，为细胞受正介电电泳(Positivedielectrophoresis， pDEP)时的富集位置;电场梯度最小的位置出现在两电极之间，为细胞受负介电电泳(Nagetivedielectrophoresis， nDEP)时的富集位置，故而在此芯片上可以实现细胞样品在不同位置的DEP富集。从图3还可以看到，随着距电极表面距离的增加，E显著降低，DEP作用力明显下降。当距离达到30 μm时，E接近于零，介电作用力几乎消失。因此，可确认30 μm是DEP力的有效作用范围，将其作为DEP芯片管道高度可实现对样品对象的有效DEP操控。

　　3.2 影响细胞介电电泳富集的因素

　　根据介电电泳原理，细胞所受的介电电泳力F=2πε0εmr3Re[fCM]|Erms|2， 其中ε0和εm分别为真空介电常数和介质介电常数，|Erms|2为电场强度绝对值的拉普拉斯算符， Re[fCM]为ClausiusMossotti因数，其中fCM=ε*p-ε*mε*p+2ε*m， ε*p和ε*m分别代表细胞和缓冲液的综合介电常数，ε*=ε-iσ/ω，其中ε是介电常数，i代表-1，σ是电导率，ω为外加电场的角频率。因此，在实验中可以通过改变缓冲介质配比、外加电场电压和频率等参数来实现粒子的定向操控和分离分析等目的。

　　3.2.1 交流信号幅值Vpp对细胞DEP富集的影响 细胞所受介电电泳力除与电场强度E2成正比外，还与细胞半径r3成正比。因此，当Vpp相同时，结肠癌细胞的富集速度要明显快于红细胞的富集速度。实验选择0.9% NaCl医用生理盐水为缓冲溶液，固定交流信号输出频率为10 MHz，实验考察了不同Vpp时两种细胞富集的情况。 图4 红细胞和结肠癌细胞在不同电压下的富集时间

　　1. 红细胞(Red blood cell， RBC ); 2. 结肠癌细胞(Colon cancer cell)。首先界定从开始施加交流信号到细胞DEP富集过程完成细胞不再运动为止的时间为细胞的富集时间t，实验测得细胞富集时间t随Vpp的增加而减小，且同一电压下结肠癌细胞的富集时间明显小于红细胞(如图4)。当Vpp&<3 V时，DEP对红细胞的作用已极其微弱，但此时结肠癌细胞对交流信号仍有明显响应;当Vpp&>8 V时，细胞在电极间做旋涡状扰动，此时两种细胞均无法实现定位富集，这是因为细胞在叉指电极表面除受到fDEP作用外，还受到电极间交流电渗feo的影响，可以认为细胞的表观运动行为是这二者合力的结果，Vpp导致feo过大，介电电泳力不足以克服交流电渗，致使无法实现细胞DEP富集。后续实验中DEP操作电压均采用5 V。

　　3.2.2 缓冲介质和交流信号频率f对细胞DEP富集的影响 根据介电电泳原理，细胞所受的介电电泳力表达式中Re[fCM]是与外加电场频率f相关的函数。当Re[fCM]&>0时，细胞的极化程度大于介质的极化程度，在此频率范围内细胞受正介电电泳力(pDEP)作用向电场梯度较大的位置移动;当Re[fCM]=0时， FDEP也等于零，此时细胞不受介电电泳力作用，将这一情况下对应的外加交流电场频率定义为临界频率f0;当Re[fCM]&<0时，细胞的极化程度小于缓冲介质的极化程度，在此频率范围内细胞受负介电电泳力(nDEP)作用向电场梯度较小的位置移动。因此，可以通过施加交流电压频率变化来控制实验所用的红细胞和结肠癌细胞的介电电泳行为及其在DEP芯片上的移动和富集位置。

　　分析物、溶液电导率和施加交流电场的频率共同决定了FDEP的方向，而在确定体系中待测对象的电导率σp是固定不变的，因此，溶液电导率σm是介电电泳过程中除交流信号频率f以外，影响细胞DEP受力方向的重要因素。表1所示为PBS磷酸盐缓冲液和0.9% NaCl中，施加5 V的交流信号时，红细胞的的正负介电电泳运动情况的转换过程，可以获得红细胞再两种缓冲介质中临界频率f0分别出现在2.5和3 MHz附近。同理，获得了在0.9%NaCl中，施加5 V的交流信号时，结肠癌细胞的临界频率f0为5 MHz。据此，可通过控制施加交流电压的频率来控制细胞的正负介电电泳行为，从而控制细胞在DEP芯片上的移动和富集位置。表1 红细胞在不同缓冲液和频率中的介电电泳类型

　　Table 1 DEP response types of red blood cells in different buffer and frequencies频率

　　0.9% normal saline++++0--/注(note)：“+”: pDEP; “-”: nDEP; “0”: 临界频率(crossover frequency)。 实验发现，在临界频率附近时，细胞运动不明显，且在临界频率两侧细胞运动方向出现逆转，红细胞和结肠癌细胞的正负介电电泳富集如图5所示。当f&<3 MHz时，红细胞和结肠癌细胞均受nDEP作用，富集于叉指电极之间;当f=3 MHz时，红细胞受介电电泳力作用不明显，而此时结肠癌细胞仍受nDEP作用富集在两电极之间;当f=5 MHz时，结肠癌细胞运动不明显，红细胞受pDEP作用富集于电极边缘;当f&>5 MHz时，两种细胞都受pDEP作用富集在电极边缘。交流信号频率过低时(f&<0.5 MHz)，电极周围出现气泡且细胞极易溶膜。在高压低频时更易发生细胞溶膜现象，其对细胞原位富集有负面影响，但可以将其与其它芯片检测手段联用，后续检测细胞溶膜后释放出的蛋白质、DNA片段等物质。

　　3.3 结肠癌细胞富集效率测定

　　控制细胞流速为50 μL/min，对进入a的细胞计数得M1=164。图6a中叉指电极表面仅有少量沉降的结肠癌细胞，此时细胞已经进样，但还未施加交流信号。将交流电信号控制为10 MHz， 5 V，此时结肠癌细胞受pDEP作用，细胞富集于电极边缘，如图6b所示。富集过程结束后对电极边缘的细胞计数，M2=143，富集效率M=M2/M1×100%=87.2%。变换交流电信号为3 MHz，5 V，重复以上实验操作，此时细胞受nDEP作用，主要富集在电极中间电场强度相对较弱的位置，如图6c所示。此时，M2=139，M=84.8%。

　　4 结 论

　　以集成PDMS玻璃复合式阵列叉指电极DEP芯片分析系统为操作平台，对红细胞和结肠癌细胞的pDEP和nDEP原位富集过程实验研究。实验结果显示，细胞富集效率同交流信号幅值Vpp呈正比，样品几何尺寸越大，其受到的介电电泳力也相应增加;在0.9% NaCl中，红细胞和结肠癌细胞的介电电泳临界频率分别出现在3和5 MHz;在不同的缓冲溶液中，同种细胞的介电电泳行为也存在显著差异。应用该芯片系统对116型结肠癌细胞进行富集，其pDEP和nDEP富集效率分别为87.2%和84.8%。

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