酶免疫测定中待测物体积占体系百分比与抑制中浓度的关系

【关键词】 酶免疫测定中待测物体积占体 中浓度的关系

　　 1 引 言

　　抑制中浓度(IC50)是指小分子物质酶免疫测定中抑制率为50%时的待测物浓度。现今文献中IC50值多以浓度表示。但是，IC50值与待测物体积占体系百分比相关。由于样品中存在干扰抗体或酶活性的物质。加样量越少，体系中由样品所带来的干扰物质越少，测定可能会更准确。实际上仅凭IC50值并不能真实反应检测方法的灵敏性。本实验以筛选的反式玉米素(tZR)单抗及其酶标物建立的直接竞争ELISA来研究IC50值与待测物加样量的关系。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂 96孔酶标板(美国Costar公司);Multiskan MK3酶标仪(芬兰Thermo公司)。反式玉米素、反式玉米素核苷、二氢玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤核苷、6苄基腺嘌呤、辣根过氧化物、牛血清白蛋白、卵清白蛋白及邻苯二胺均购自美国Sigma公司。

　　2.2 实验方法 (1)tZR免疫抗原、包被抗原和酶标物(tZRHRP)的合成 采用高碘酸钠氧化法制备tZR与BSA、OVA和HRP的联结产物，分别作为免疫抗原、包被抗原和酶标物。(2)小鼠免疫与单克隆抗体的制备 用PBS将tZR免疫抗原稀释成1.0 g/L，初次免疫用完全弗式佐剂与等体积的免疫原混合，充分乳化，免疫5只小鼠，每只小鼠的免疫量为200 μL。加强免疫用不完全弗式佐剂乳化。经4次免疫后，用ELISA对小鼠血清进行检测，效价和特异性较好的小鼠直接用免疫原溶于PBS进行腹腔免疫，4 d后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过筛选、克隆得到能稳定分泌抗体的细胞株。(3)抗体性质的鉴定 抗体的型及亚型鉴定用鼠抗体亚型检测试剂盒检测，腹水效价用ELISA检测。(4)棋盘格实验 采用棋盘法确定不同体系下(待测物体积占反应体系10%～90%)tZR抗体及tZRHRP的稀释倍数。tZR鼠单克隆抗体及酶标物的原始浓度分别为2.0和0.2 g/L。

　　3 结果与讨论

　　3.1 杂交瘤细胞株的建立及抗体的性质 脾细胞经融合、筛选、克隆后得到一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为2B5C3F2。腹水效价为2×104～3×104。单克隆抗体属于IgG1亚类，轻链属于κ型。抗体与tZ，　iPA，　DHZR和6BA的交叉反应率分别为48.37%，　1.38%，　2.36%和0.15%。

　　3.2 直接竞争ELISA最适工作条件的筛选 由于tZR的绝对量随样品加入到孔中的体积百分比不同而不同，因此标准曲线的浓度范围分别设定为0～5， 0～10和0～50 μg/L(对应的待测物占体系60%～90%， 50%， 10%～40%)。用棋盘格实验得出待测物体积占体系百分比10%～90%各自最适工作条件，抗体稀释倍数均为1/400，酶标半抗原稀释倍数依次为1/70， 1/65， 1/60， 1/55， 1/50， 1/45， 1/40， 1/35和1/30。

　　3.3 直接竞争ELISA标准曲线的建立及IC50值测定 如将50%的体系作为参照系，假定待测物占反应体系50%时，待测物和酶标物在反应体系中的浓度为a和b，那么在待测物体积占反应体系n%时，为保持待测物和酶标物在反应体系中浓度a和b不变，可以将加入前的待测物浓度变为原浓度的50/n，而将加入前的酶标物浓度变为原浓度的50/(100-n)。这样孔中实际的酶标物与待测物的量与50%体系的完全一致，而抑制曲线的每一个待测物浓度均变为原浓度的50/n。理论上IC50值相应就变为(50/n)×50%体系的IC50值(IC50(50%))。由待测物体积占体系百分比10%～90%理论值与测定值(见全文)可以看出，IC50实际测定值与理论值都随待测物占反应体系百分比的增大而降低。本实验的IC50实测值与理论测定值虽然相近，但在10%～40%体系，IC50实测值比理论值偏大，在60%～90%体系，IC50实测值比理论值偏小。在10%～40%体系中，tZRHRP实际量比理论量偏高，为理论量的1.09～1.38倍，酶标板上抗体结合的酶较多，每个浓度的显色值偏高，相应的IC50值也偏大;在60%～90%体系，tZRHRP实际量比理论量偏小，为理论量的0.33～0.89倍，酶标板上结合的酶较少，相应的IC50值也偏小。酶标物的量与理论量相差越大，实际测定的IC50值与理论值的偏差也越大