生物相容性分离介质在样品前处理中的应用

　　　　　　 作者：潘加亮 胡玉玲 李攻科

【摘要】 生物样品基体复杂，蛋白质等生物大分子的干扰给样品前处理带来很大的困难。近年来，生物相容性分离介质在样品前处理中的应用特别引人注目。本文综述了生物相容性分离介质及其在固相萃取、固相微萃取、微透析样品前处理中应用的进展。

【关键词】 生物相容性，分离介质，样品前处理，综述

　　 　　 1 引 言

　　近年来，无溶剂或少溶剂的样品前处理技术发展迅速，如固相萃取(Solid phase extraction， SPE)、固相微萃取(Solid phase microextraction， SPME)及微透析 (Microdialysis， MD)等，其中分离介质的选择是实现分析物采样、分离、富集的关键，因此发展选择性高、富集能力强的分离介质成为样品前处理技术的研究热点。在生物样品前处理过程中，复杂基体对分离介质的干扰和破坏，以及分离介质对生物体的影响(如致毒、免疫排斥)，是普遍存在的问题。因此，发展生物相容性分离介质对生物样品采样、分离分析具有重要意义。

　　在生物医学领域，生物相容性是指医用或药用材料与生物体相容的性质，即材料在实际应用中产生的材料反应和宿主反应的性质。材料和生物机体的相互作用主要表现在两方面：一是材料反应，即活体对材料的作用，包括生物环境对材料的腐蚀、降解、磨损和性质退化，甚至破坏;二是宿主反应，即材料对活体系统的作用，包括局部和全身反应，如炎症、细胞毒性、凝血、过敏、致癌、致畸和免疫反应等。当材料进入机体后，在一段时间内会发生材料反应和宿主反应，反应后材料不失去其基本功能，也不引起机体的不良反应，则可认为该段时间内材料具有良好的生物相容性[1]。在分析化学领域，分离介质的生物相容性是指分离介质在生物环境中仍保持良好的分离与富集能力，同时不引起生物体免疫排斥等不良反应的性质。在生物样品前处理中，采用生物相容性分离介质，能避免蛋白质等大分子的在介质表面的吸附[2]，减少基体的干扰、延长介质的寿命，有望实现生物体的原位采样及在线检测。

　　生物样品中蛋白质等生物大分子通常是引起干扰的主要基体。因此，生物相容性介质必须具备两个条件：有亲水的表面，能避免蛋白质变性和吸附;孔径足够小，使蛋白质等大分子排阻在孔穴外。作为分离介质，还必须对分析对象具有分离、富集能力。

　　2 生物相容性分离介质

　　2.1 吸附型生物相容性分离介质

　　2.1.1 限进介质(Restricted access media， RAM) 限进介质的研究从20世纪80年代中期开始，是目前在生物样品前处理中使用最广泛的生物相容性分离介质。RAM外表面经过亲水修饰且具有合适的孔径，使得生物样品中蛋白质等大分子不能进入介质的内孔，避免发生不可逆吸附;内孔表面通常具有反相萃取剂或离子交换萃取剂的性质，能吸附小分子，如图1所示[2]。烷基二醇硅胶 (Alkyl diol silica， ADS)外表面键合有高度亲水的二醇基，内孔表面键合C4， C8， C18或苯基等基团，既能排阻分子量大于15000的蛋白质等大分子，也能萃取生物样品中低极性的小分子，是目前最常用的RAM材料。 图1 限进介质颗粒示意图[2]

　　Fig.1 Schematic representation of restricted access media(RAM) particle[2]

　　2.1.2 聚(甲基丙烯酸乙二醇二甲基丙烯酸酯) 聚(甲基丙烯酸乙二醇二甲基丙烯酸酯)(Poly(methacrylic acidethylene glycol dimethacrylate)， Poly(MAAEGDMA))是指酸性单体甲基丙烯酸(MAA)和双功能基交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)的共聚物，其生物相容性良好，在生物医学领域使用广泛。该聚合物具有疏水的骨架以及酸性的侧基，对碱性物质具有很好的吸附作用，且在较宽的pH范围内性质稳定，适合用作固相萃取或管内固相微萃取的固定相。

　　2.1.3 分子印迹聚合物(Molecular imprint polymer， MIP) 分子印迹聚合物是指将待分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预组装，再与交联剂共聚得到的聚合物。除去目标分子后，聚合物中形成与目标分子空间互补并具有预定作用位点的“空穴”，因此对目标分子的空间结构有“记忆”效应，能够高选择性地识别复杂样品中的印迹分子。高选择性是MIP的特点，但能否避免蛋白质等大分子的吸附，取决于聚合物本身的性质。目前，常见的MIP是以MAA为功能单体， EGDMA为交联剂，与 Poly(MAAEGDMA)有类似的性质，作为吸附剂广泛应用于固相萃取。

　　2.1.4 免疫吸附剂(Immunosorbents， ISs) 免疫吸附剂是一种基于抗体和抗原相互作用原理而实现高选择性萃取的分离介质。将针对被测物的特异性抗体固定在载体上，制得免疫吸附剂。多克隆抗体可通过把抗原或半抗原载体蛋白结合物注入实验动物体内产生，单克隆抗体则必须通过培养某种特定的杂交瘤细胞来制备。前者成本较低，抗体成分复杂，专一性差;后者价格昂贵，抗体成分单一，专一性强。载体主要是琼脂糖、纤维素和硅胶等生物惰性的材料。相比其它生物相容性分离介质，ISs选择性高，在蛋白质等生物大分子的分离纯化方面具有独特的优势。

　　2.1.5 其它吸附型生物相容性分离介质 聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane)， PDMS)作为商用的固相微萃取涂层材料，已被广泛使用，有报道用于鱼组织的原位采样[3]。聚吡咯(Polypyrrole， PPY)是导电聚合物，通过电化学方法合成，有良好的生物相容性和导电能力，应用于血管组织工程、生物传感领域，如PPY镀在金属表面，能改善金属支架材料的生物相容性。聚乙二醇(Polyethyleneglycol， PEG)属于水溶性高分子，在水中的界面自由能很低，有较好的抗血栓性，血液相容性良好。聚丙烯腈(Polyacrylonitrile， PAN)用于分离生物体系亚微米级别的颗粒，在透析和超滤方面有广泛的应用。在高通量透析治疗中，能滤去低中分子量的蛋白质，是一种生物相容性优良的聚合物。但聚乙二醇和聚丙烯腈萃取性能并不好，通常与其它分离介质结合使用。

　　2.2 生物相容性膜

　　膜是一种具有“选择性透过”功能的非吸附型分离介质。应用最广泛的生物相容性膜是高分子材料，主要由天然高分子材料与合成高分子材料两大系统组成。多糖和纤维素是常见的生物相容性天然高分子。壳聚糖、甲壳素等多糖类高分子可生物降解，不容易导致蛋白质失活、变性，常作为药物载体、硬组织修复材料使用，亦可用于固定酶、抗体等蛋白质。纤维素以其良好的组织相容性和血相容性，成为第一代透析膜材料，包括再生纤维素(如铜氨纤维素、皂化纤维素、粘胶纤维素)以及纤维素衍生物(如醋酸纤维素、羟甲基纤维素)。与天然高分子膜相比，合成高分子膜具有更优良的物理性能和化学稳定性，广泛用于人工器官、血液透析和药物缓释。聚砜、聚醚砜、聚芳醚砜、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺等都是常用的膜材料。高分子膜材料的表面改性是提高生物相容性的主要途径，目前已成为生物医用材料学科最活跃、最引人注目和发展最迅速的领域之一[4]。

　　3 生物相容性分离介质在样品前处理中的应用

　　3.1 生物相容性分离介质在固相萃取中的应用

　　3.1.1 限进介质固相萃取技术(RAMSPE) 商品化的固相萃取吸附剂(如C8、C18、离子交换树脂等)的生物相容性差，选择性低。在富集分析物的同时，大量的基体和干扰物质也被富集，导致后续分析困难。蛋白质与吸附剂形成不可逆吸附，严重影响SPE材料的使用寿命。RAM能去除蛋白质、核酸和腐植酸等大分子的干扰，是理想的SPE吸附剂。RAMSPE柱通过柱切换装置与分析柱连接，与高效液相色谱(HPLC)在线联用[5，6]，RAMSPEHPLC集样品净化、富集、分离、检测于一体，是实现生物流体直接进样、快速自动化分析的有效方法[7]。RAMSPE主要应用于生物体液的分析，涉及的样品有牛奶、血液、血浆、血清、尿液等，测定对象主要是药物及其代谢物。近年来，关于RAMSPE毛细管柱，包括填充柱[8]和整体柱[9]已有报道。其与毛细管液相色谱(cLC)在线联用，适于微量生物流体的直接进样分析。富集倍数低和选择性差是目前RAM存在的主要问题，需要开展新型RAM材料的研究。Wa等 [10]在硅胶的内孔固定抗体，首次制备了免疫亲和限进介质(IARAM)，该材料对游离的荧光素有良好的选择性，能在2 s内达到吸附平衡且该时间段内基本不吸附与蛋白结合的荧光素，有望应用于药物蛋白质相互作用的研究。

　　3.1.2 分子印迹固相萃取技术(MISPE) 自1994年Sellergren首次报道在SPE中使用MIP材料以来[11]，分子印迹固相萃取技术发展迅速，并且已经实现商品化。相比RAMSPE，MISPE能有效减少小分子物质对测定的影响，但抗大分子基体干扰的能力并不显著。RAM柱与MIP柱协同萃取是同时实现大分子排阻与小分子选择性富集的有效途径。文献[12～14]报道了限进介质分子印迹多维固相萃取的方法，即RAMSPE和MISPE多柱在线联用，适用于复杂样品的痕量分析。研制对大分子具有“限进”作用的MIP(即RAMMIP)是提高MIP生物相容性的有效方法。Haginaka等[15]采用多步溶胀法制备MIP微球，并在聚合过程中加入1， 2丙二醇单甲基丙烯酸酯和1， 2丙二醇双甲基丙烯酸酯，对微球表面进行亲水修饰，首次制得RAMMIP，应用于血清、河水的直接进样分析[15～21]。如何对MIP表面进行亲水修饰是制备技术的关键。最近Puoci等[22]使用甲基丙烯酸环氧丙酯作为MIP的共聚单体，在聚合完成后用高氯酸处理，使表面的环氧基团开环生成邻二醇，既获得亲水的表面，又避免了羟基对印迹效果的影响。RAMMIP应用前景广阔，但生物样品通常是富水样品，而MIP水相选择性较差，制约了RAMMIP的发展。研制具有水相印迹功能的MIP，并与RAM技术相结合是今后研究的主要方向。

　　3.1.3 免疫亲和固相萃取技术(IASPE) 基于抗体抗原特异性识别作用的免疫亲和固相萃取技术，集净化、富集于一体，适合于复杂生物样品中大分子的分离纯化以及小分子的痕量分析。主要分析对象有真菌毒素(如黄曲霉素[23]、赭曲霉素[24])、药物(如克仑特罗[25])、兽残农残(如苯基脲类除草剂[26])和神经肽[27]等，涉及样品有血液、尿液、肾脏、肝脏、肌肉、毛发以及植物组织。由于IASPE的净化能力强，后续分析简单，通常与高效液相色谱、高效毛细管电泳在线联用[28]，易于实现自动化。也有报道IASPE与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)联用[29～31]，免去色谱分离过程，缩短分析时间。

　　免疫吸附剂的高选择性不利于IASPE进行多对象的同时分析。文献[32，33]采用三通阀串联多根含有不同抗体的IASPE柱，实现了单一样品多成分的同时萃取。此外，制备多抗体的免疫吸附剂也是拓展IASPE应用范围的有效途径[34，35]。目前，毛细管和芯片是IASPE微型装置的两种主要形式，微型化的IASPE省时低耗，在微流体分离分析方面有较大的应用潜力[36，37]。

　　3.2 生物相容性分离介质在固相微萃取中的应用

　　3.2.1 限进介质固相微萃取技术(RAMSPME) 文献[2，38～42]报道了一系列以限进介质作为SPME涂层材料的相关研究。主要有ADS(C18)和离子交换二醇硅胶(Ion exchange diol silica， XDS)两种RAM涂层，均可省去沉淀蛋白质的步骤，用于生物体液的直接萃取。ADSSPME与HPLC在线联用，应用于血样、尿样中苯(并)二氮类药物的分析[38，38，42];XDSSPME与HPLC/MS联用，分析全血中的血管紧缩素1，检出险为8.5 pmol/L[40]。这两种涂层用于胰蛋白酶的消化物和生物体液中缩氨酸的定性分析，在不需经其它纯化处理的条件下，RAMSPME与纳喷雾质谱在线联用，检出限达到50 pmol/L[41]，方法快速灵敏，易于自动化，有望应用于蛋白质组学的研究。

　　如何提高吸附容量是RAM在微萃取中应用中必须解决的问题，除了研制新型的RAM材料外，发展合适的RAMSPME形式也是有效的方法。最近，Jarmalaviciene等[43]将RAMSPME小柱嵌入毛细管中，与区带毛细管电泳(CZE)实现在柱联用(in line)，不需要柱切换装置，直接进样分析牛血浆中的咖啡因，灵敏度比CZE方法提高1000倍。Lambert等[44]报道了基于RAM的搅拌棒吸附萃取技术(RAMSBSE)，RAMSBSE与SPME探针相比，吸附容量大、平衡速度快，能避免搅拌器的竞争吸附，是RAMSPME技术的延伸。

　　3.2.2 基于聚(甲基丙烯酸乙二醇二甲基丙烯酸酯)的管内固相微萃取技术(Poly(MAAEGDMA)in tubeSPME) Fan等[45] 用(γ甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷对石英毛细管进行硅烷化处理，然后通入聚合溶液(MAA为单体、EGDMA为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂、十二醇与甲苯为致孔剂)，直接在毛细管内壁进行聚合，制得管内固相微萃取毛细管柱。管内固相微萃取与高效液相色谱[46～49]、毛细管区带电泳[50，51]、毛细管液相色谱以及加压毛细管电色谱[52]在线联用，直接进样分析人体血液、尿液、唾液中的碱性药物。方法精密度良好，动态范围大部分可达3个数量级或以上。由于该聚合物整体柱较强的抗干扰能力以及良好的化学稳定性，在管内固相微萃取原位衍生化方面有较大的应用潜力[53]。

　　3.2.3 免疫亲和固相微萃取技术(IASPME) Yuan等[54]采用戊二醛连接抗体和石英纤维(用氨丙基三乙氧基硅烷偶联剂处理)，实现茶碱抗体在纤维表面的固定，首次制得免疫亲和固相微萃取涂层，应用于尿液中茶碱的分析，省去繁琐的前处理步骤和后续色谱分离过程。Lord等[55，56]用相同的方法在硼酸硅盐玻璃棒表面固定苯(并)二氮类化合物的抗体，应用于加标尿样中氟硝西泮的代谢物7硝基氟硝西泮[56]以及其它苯(并)二氮类药物的分析[55]。与IASPE技术相比，IASPME操作简单，低耗省时，但方法线性范围窄(不超过2个数量级)，富集能力差，需要更灵敏的后续检测手段，这与涂层活性位点的密度和面积较小有关[55]。提高涂层有效面积和抗体的密度是制备技术亟需解决的问题。Queiroz等[57]用类似的方法把抗体固定在熔融石英毛细管内，制得固相微萃取小柱，与HPLC/MS联用，分析血清中的氟西汀，检测限达5 μg/L，RSD低于5%。

　　商品化的抗体种类众多，选择范围宽，因此IASPME具有广阔的应用前景。溶液的pH值与离子强度对抗体蛋白结构有较大的影响，是制约涂层萃取性能的两个重要因素，不利于生物样品的原位采样。

　　3.2.4 分子印迹固相微萃取技术(MISPME) MISPME结合了MIP的高选择性与SPME易于联用的优势，近年来备受关注。目前MISPME装置有3种形式：(1)纤维表面涂渍MIP。Koster等[58]首次报道了在SiO2纤维表面涂渍MIP，一次涂渍厚度达75 μm，厚度的偏差小于10%。本研究组采用多次涂渍的方法制备了MIP涂层，与高效液相色谱在线联用，分析生物样品中痕量的三嗪类除草剂[59，60]、四环素类抗生素[61]以及心得安类β受体阻滞剂[62]，除草剂和抗生素检出限均低于欧盟要求的最大限量，心得安检测灵敏度满足人体血液或血浆痕量监测的要求。(2)管内MISPME。Mullett等[63]首次报道管内MISPME的研制，分析血清中的心得安，方法检出限为0.32 mg/L，RSD&<5.0%。这种MISPME形式与高效液相色谱在线联用时，解吸溶剂和色谱流动相通常较难匹配。(3)纤维状MIP作为固相微萃取涂层。Turiel[64]与Djozan[65～67]等各自报道了一种纤维状MIP固相微萃取涂层的制备方法：以石英或玻璃毛细管为模具，通入聚合溶液，反应结束后用化学腐蚀或物理破坏的方法去除MIP表面的部分石英或玻璃，裸露出一定长度的MIP，制得纤维状固相微萃取涂层。这种方法操作简单，厚度容易控制，但由于涂层部分没有底材支持，仅适用于具有一定韧性与硬度的MIP材料。

　　受制备方法的限制，目前的涂层大部分是机械性能较好的MIP，如MAAEGDMA共聚物。Prasad等 [68～71]报道一种溶胶凝胶制备方法，在聚甲基丙烯酸甲酯纤维表面涂布一层聚硅氧烷，MIP以“聚合物刷”的形式嫁接在聚硅氧烷表面，这种溶胶凝胶嫁接MIP 的制备方法有望拓展MIP在SPME中的应用。MIP涂层的高选择性通常只在非极性溶剂中表现出来，目前大多数MIP涂层只用于萃取经有机溶剂提取后的样品，限制了MISPME的应用，因此研制具有水相印迹效果的MIP涂层非常必要，使用能与模板分子存在非氢键作用(如疏水作用、ππ作用)的单体是有效的方法。最近，Li等[72]采用溶胶凝胶法，以苯基三甲氧基硅烷为功能单体，制备的MIP能在水相中识别对多溴联苯醚。

　　3.2.5 其它生物相容性固相微萃取涂层 聚吡咯(PPY)涂层是最早用于活体采样的涂层材料[73]，已有报道PPYSPME探针插入老鼠与狗的静脉中进行采样[73～75]。PPY涂层为多孔吸附介质，结合位点有限，生物体中内源性的小分子化合物与目标物存在竞争吸附，严重影响分析结果，导致方法线性范围窄。与PPY相比，PEG与C18键合硅胶结合的固相微萃取涂层较薄，传质速度快，萃取容量大，是更理想的生物相容性涂层[75～77]。文献[78，79]报道了一种基于聚丙烯腈(PAN)的固相微萃取涂层：将C18键合硅胶颗粒分散于PAN的DMSO溶液中形成浆状物，涂渍在不锈钢丝表面。研究表明，该涂层对蛋白质的吸附量低于RAM、PPY涂层，对安定等药物的萃取能力分别提高了50和90倍。PAN涂层的生物相容性良好，而且能够根据分析对象的需要选择适当的吸附剂结合使用，在体内药物分析领域有较大的应用潜力。生物相容性涂层研究的发展，使得SPME技术可以实现活体采样、在线分离检测，有望成为临床分析的新手段[75]。选择性高、富集能力强的生物相容性涂层的研制和应用是今后SPME技术发展的一个方向。

　　3.3 生物相容性分离介质在微透析中的应用

　　3.3.1 微透析技术(Microdialysis， MD) 微透析技术利用渗析原理实现采样。透析膜内外存在浓度梯度，透析膜外的分析物浓度高于膜内，蛋白质等大分子被透析膜截留在膜外，小分子通过扩散进入透析管，并被透析管内持续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织原位采样的目的，原理如图2所示[80]。 图2 微透析示意图[80]

　　Fig.2 Schematic of microdialysis[80]

　　微透析膜与生物体液、组织直接接触，是微透装置的关键部分，膜材料的生物相容性、孔径和尺寸是影响微透析萃取效率与回收率的重要因素。目前，国际上能生产微透析膜的公司不多，如瑞典的CMA、美国的BAS及日本的EiCOM公司。常见的膜材料有聚砜、聚醚砜、铜纺膜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚碳酸酯以及碳酸脂与醚的共聚物等。

　　膜与小分子及蛋白质相互作用是两个不容忽视的问题。膜材料对待测物的吸附会影响微透析探针回收率的稳定性，过多的吸附会造成探针效能在连续实验过程中降低。如聚砜膜有一定的疏水性，容易吸附小分子溶质，造成膜污染。目前微透析膜吸附蛋白质的问题仍然存在，聚合物的共混和共聚是进行膜改性的两种途径。2甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2methacryloyloxyethylphosphorylcholine， MPC)聚合物生物相容性良好，与聚砜共混形成聚合物合金，制得的中空纤维膜，能有效减少蛋白质的吸附[81]。MPC[82]、PEG[83]及聚乙烯酰胺(Poly (ethylene imine))[84]接枝共聚在透析膜上，能提高材料的生物相容性。

　　3.3.2 微透析技术应用进展 微透析技术是一种将灌流技术与透析技术相结合的新型的生物采样技术，主要应用于生物活体采样，包括动物体和人体[85]，出现于20世纪70年代，最早用于大鼠神经传递质多巴胺的研究[86]。微透析探针可埋植于血液、肝脏、皮肤等各种部位，对生物体细胞液的内源性或外源性物质进行连续取样，所造成的微创不足以破坏生物体内环境。微透析样品不含蛋白质等大分子杂质，不需要复杂的样品处理，因此微透析技术已经与多种分析技术联用，如高效液相色谱、高效毛细管电泳、质谱、酶法分析、核磁共振等，目前已成为实验神经生理学、神经化学以及药代动力学等领域重要的实验研究技术。微透析装置已经实现商品化， 20世纪90年代， CMA公司开始推出适用于临床应用的产品。

　　目前微透析技术仍存在不足之处：探针回收率较难控制，校正和定量困难;采样量极少，缺乏高灵敏检测器。微透析技术应用的一个重要方向是实现活体动态生化分析，连续跟踪体内多种化合物含量随时间的变化。受分析方法的限制，现在微透析技术时间分辨率较低，达到分钟级。要开展时间分辨率达到秒级的动态生化分析，急需发展快速、高灵敏度的检测方法，如激光诱导荧光、化学发光和高灵敏质谱等方法[87，88]。4 结 语

　　实现活体、原位采样，在线、实时检测是分析化学的发展方向，分离介质的生物相容性是生物样品分离、富集的必要条件。目前分离介质在生物相容性和萃取能力方面仍不能满足复杂生物样品前处理的需要，尤其在体内分析领域，制约了活体采样技术的发展。今后的研究可从以下两方面开展：第一，研制富集能力强、选择性高的新型生物相容性分离介质。生物惰性材料与吸附材料相结合(如聚乙二醇或聚丙烯腈与C18键合硅胶的复合材料)是一个较为有效的途径。将限进介质与分子印迹技术、免疫亲和技术相结合，集净化与高选择性富集于一体，具有较大的发展潜力。第二，发展安全、简便、高效、易于联用的活体采样技术，包括采样装置的研制、生物相容性评价方法的建立以及分析方法的开发。固相微萃取技术集采样、分离、富集于一体，能与多种分析手段在线联用，在体内分析方面应用前景广阔。但与微透析技术相比，SPME活体采样装置的研究仍在起步阶段，涉及样品的种类较少;至今尚无完善的体外预测、评价SPME涂层生物相容性的方法;两种活体采样技术在分析方法方面都存在定量和校正困难的问题，均有待研究工作的深入开展。

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