傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段

　　　　 作者：蒋鑫萍 程舸 于雷 王韶 刘晓梅 石磊

【摘要】 采用高效液相色谱(HPLC)SCX及C4色谱柱从人乳样品的乳清部分分离与纯化出骨桥蛋白(Osteopontin， OPN)，在一定条件下将其用胰蛋白酶酶解后，利用高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)，结合微喷雾(Nanospray)技术，并借助Mascot软件数据库，获得了OPN相关多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱结构信息，分析了其裂解机理。研究表明，利用FTICRMS并结合HPLC等化学方法，可以高效、快速地分离与纯化人乳样品中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，能够简洁、准确地鉴定相关多肽片段的结构信息，为OPN多肽片段不同翻译后修饰位点的确定与其生物学活性关系的研究提供了理论依据。

【关键词】 傅立叶变换离子回旋共振质谱，人乳，骨桥蛋白，多肽片段

　1 引 言

　　随着现代生物技术的进步和生命科学的发展，多肽在生物体内的生理功能越来越受到重视，从天然产物中获得具有生物活性多肽类物质的方法也不断发展。骨桥蛋白(Osteopontin， OPN)是一种重要的多功能细胞外基质蛋白[1]，能在骨组织细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞上表达[2]，在介导细胞的趋化、粘附、增殖和迁移，以及骨组织的矿化与重建、免疫调节、信号传导等方面起着重要作用[3，4]。OPN是一种含精氨酸甘氨酸天冬氨酸(ArgGlyAsp， RGD)带负电荷的分泌型糖基化磷蛋白，其中包含16个氨基酸的信号肽，剪切后形成298个氨基酸的成熟蛋白，理论分子量约为33 kDa。但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75 kDa[5，6]。OPN含有多个与整合素结合的功能域，磷酸化后的OPN主要是以RGD结构与细胞表面的整合素受体(αγβ1，αγβ3)结合，SVVYGLR多肽位点可以结合α4β1，α4β7和α9β1，而未磷酸化的OPN则不依赖于RGD结构与某些CD44的变异体结合，OPN和细胞表面受体相互作用能诱导信号传导，从而促进细胞的粘附和迁移[7～10]。在类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis， RA)的病灶中会出现OPN的过度表达，它可能通过调节病灶部位细胞因子的分泌来调控RA病理过程中的炎症反应[11，12]，并且由于病因不同以及与药物的作用将导致OPN细微结构的复杂化，即会出现不同位点磷酸化或糖基化修饰的OPN多肽片段。因此，从OPN中典型的多肽片段入手，寻找RA中促炎症作用调控网络起关键作用的炎症因子靶点，对于深入认识RA的发病机理和研发新的RA药物具有重要的指导作用。

　　傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)以高分辨率、高质量检测上限、高扫描速度、宽的动态范围和高质量准确度等技术优势[13～15]，越来越广泛地应用到生命科学，特别是在生物大分子的研究中。同时，以基质辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术为代表的新型离子化方法也给FTICRMS拓展了更广泛的应用空间。迄今为止，蛋白质组学研究策略主要包括 “Bottom Up” 和 “Top Down” 两种方法。“Top Down” 是在蛋白质水平上鉴定和研究蛋白质，将完整的蛋白质分子离子有效地解离以获得蛋白质翻译和翻译后修饰及蛋白质非共价键复合物等结构信息[16]。而 “Bottom Up” 是在多肽水平上鉴定和研究蛋白质，对蛋白质纯度要求不需象二维电泳纯化的蛋白那么高，即可将蛋白质酶解成多肽后再进行分析，覆盖率可达100%，不仅增强了鉴定的可信度，也能更好地鉴定蛋白质翻译后的修饰位点[17，18]。

　　本研究采用 “Bottom Up” 并结合HPLC和配有Nanospray技术的高分辨FTICRMS等化学方法，快速分离并纯化了人乳中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，准确鉴定了OPN中有代表性的多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱裂解机理。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　7.0 T傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICRMS，Thermo公司); 超高速离心机(美国Alfa Wassermann公司);高压液相色谱(美国Waters公司); SCX和C4色谱柱(Sigma公司)。

　　尿素、DDT、TFA、碘化乙酰胺、胰蛋白酶、柠檬酸、柠檬酸铵和乙腈均购自Sigma公司;其它试剂均为国产分析纯。

　　2.2 骨桥蛋白的分离与纯化

　　将人乳样品从-20 ℃冰箱中取出，室温放置2 h后，量取若干样品于Eppendorf管中，以14000 r/min离心45 min，温度控制在不超过0 ℃。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分和乳粒部分。OPN在中层的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白，采用高效液相色谱配有SCX柱进行初步分离得到8个组分。首先将跟踪、鉴定出OPN的SCX5和SCX6组分合并，然后继续用C4色谱柱进行HPLC分离，最终纯化出乳清部分的蛋白OPN。

　　2.3 蛋白质样品酶解

　　5 μg OPN样品与90 μL 0.1 mol/L NH4HCO3， 20 μL 6 mol/L尿素、4 μL 100 mmol/L DDT在56 ℃共同孵育1 h，冷却至室温使其变性与降解。加入4 μL 500 mmol/L碘化乙酰胺于室温孵育30 min进行烷化反应。加入100 μL 0.1 mol/L NH4HCO3并同时加入胰蛋白酶，于37 ℃孵育16 h消化降解。加入4 μL 100%乙酸和81 μL 0.1%乙酸，进行淬火反应使反应终止，蛋白OPN即被酶解为多肽片段。

　　2.4 色谱与质谱条件

　　2.4.1 SCX色谱柱色谱条件 流动相A 为20 mmol/L柠檬酸柠檬酸铵(pH 3.0) ， 流动相B 为20 mmol/L柠檬酸柠檬酸铵0.5 mol/L NaCl，(pH 3.0)。 梯度洗脱：0～20 min， 100% A; 20～30 min， 100%～90% A; 30～40 min， 40%～0 A。在洗脱的过程中保持总流速为1 mL/min。UV检测器，最大波长为280 nm，柱温为35 ℃。

　　2.4.2 C4色谱柱色谱条件 流动相A为 0.1%(V/V) TFA的水溶液，流动相B为 0.1%(V/V) TFA9.9% 水90%乙腈。梯度洗脱：0～10 min， 100% A; 10～20 min， 80%～60% A; 20～45 min， 60%～40% A，45～55 min， 40%～0 A。在洗脱的过程中保持总流速为1 mL/min，UV检测器，最大吸收波长为280 nm，柱温为40 ℃。

　　2.4.3 质谱条件 多肽溶解于V(水)∶V(甲醇)∶V(乙酸)=49∶49∶2混合溶液中，将样品置于96孔板自动进样系统中，利用配有Nanospray技术(长15 cm的Proxeon nanoESI 发射器，填充物为直径3 μm的C18 树脂)的FTICRMS，测定样品的质谱图。流动相A为0.5%乙酸99.5% 水，B为90%乙腈9.5%水0.5%乙酸，流速为500 nL/min，梯度洗脱。FTICRMS金属毛细管电压：　2500 V℃ 毛细管温度：　110 ℃; 锥孔电压：　-30 V， 碰撞激发电压：2.7～3.2 V; 碰撞气体为高纯氮气，脉冲时间： 250 ms。

　　3 结果与讨论

　　3.1 骨桥蛋白的分离

　　3.1.1 人乳样品的分离 人乳样品收集自哺乳期为8个月的健康者，样品从-20 ℃冰箱中取出，室温放置2 h后，量取适量样品于Eppendorf管中，以14000 r/min离心45 min，温度控制在不超过0 ℃。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图解1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分、乳粒部分。OPN在中层的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白后，采用高效液相色谱配有SCX柱进行初步分离得到8个组分。图解1 分离与纯化人乳的流程

　　Scheme 1 Separation and purification scheme of human milk3.1.2 乳清部分的纯化 首先将跟踪、鉴定出OPN的SCX5和SCX6组分合并，然后继续用C4色谱柱对SCX5和SCX6组分进行纯化，最终得到乳清部分的蛋白OPN。具体实验结果参看人乳乳清部分的纯化流程(图解2)，得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。

　　3.2 骨桥蛋白中多肽片段的鉴定 将纯化后样品OPN利用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，利用FTICRMS串联质谱(MS/MS或MSn)，母离子的活化采取碰撞激发解离(CAD)和电子捕获诱导解离(ECD)的方式，根据多肽碎片命名规则以及CAD的CN肽键断裂和ECD的NCα断裂在裂解机理上的互补性规律(图解3)，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，分别鉴定了OPN蛋白中有代表性的双电荷分子离子峰为m/z 483.2570的多肽片段和双电荷分子离子峰为m/z 655.3816的多肽片段。

　　在双电荷分子离子峰为483.2570多肽片段的CAD谱图(图1a)中，主要得到b与y离子的信息，b+4：m/z 359.1561，b+5：m/z 458.2245，b+6：m/z 621.2882，b+7：m/z 678.3093，y+2：m/z 288.2031，y+3：m/z 345.2245，y+4：m/z 508.2878，y+5：m/z 607.3561，y+6：m/z 706.4238，y+7：m/z 793.4566，初步证明所含的多肽GDSVVYGLR片段，结合ECD谱图(图1b)中主要得到的c与z离子的信息，碎片离子Z+2：m/z 273.1433，Z+3：m/z 330.2140，Z+4：m/z 493.7763，Z+5：m/z 591.3389，Z+6：m/z 690.4080，Z+7：m/z 777.2138，进一步验证了多肽GDSVVYGLR片段的准确性。

　　同样，在双电荷分子离子峰为m/z 655.3816多肽片段的CAD谱图(图2a)中，b+3：m/z 356.1928，b+5：m/z 540.3140，b+6：m/z 637.3668，b+9：m/z 979.5573，b+11：m/z 1163.6405，y+3：m/z 331.1977，y+4：m/z 444.2816，y+5：m/z 545.3293， y+8：m/z 841.4778，y+9：m/z 954.5612，y+10：m/z 1067.6461，初步证明所含的多肽QNLLAPQTLPSK片段，结合ECD谱图(图2b)中碎片离子Z+2：m/z 218.4618，Z+4：m/z 429.2712，Z+5：m/z 530.3190，Z+7：m/z 755.4523，Z+7：m/z 826.0526，Z+9：m/z 938.5467进一步验证了多肽QNLLAPQTLPSK片段的可靠性。而且，多肽GDSVVYGLR片段和多肽QNLLAPQTLPSK片段与标准谱库匹配率(Score)分别为69和101。

　　3.3 多肽片段的相对偏差

　　Mascot 数据库软件分析结果表明，MS/MS 串联质谱显示，平均分子量为964.4977的单电荷中性多肽片段GDSVVYGLR，与平均分子量为964.4995(483.2572，2+)多肽片段GDSVVYGLR的匹配分子离子相对照，相对偏差为0 ppm。平均分子量为1308.7401的单电荷中性多肽片段QNLLAPQTLPSK，与平均分子量为1310.7632(655.3816，2+)多肽片段QNLLAPQTLPSK的匹配分子离子相对照，相对偏差为4×10-6(见图3)， 充分验证了高分辨质谱的准确性。

　　3.4 小结

　　骨桥蛋白(OPN)具有广泛的生物学活性，与人体多种疾病的发生、发展密切相关。由于病因不同以及与药物的作用将会导致OPN细微结构的复杂化，即会出现不同位点磷酸化或糖基化修饰的OPN多肽片段。因此，本实验采用“Bottom Up” 并结合HPLC及配有Nanospray技术的高分辨FTICRMS等方法，通过电子捕获解离(ECD)技术和碰撞激发解离(CAD)之间所提供离子信息的互补关系，使得OPN中多肽片段的鉴定更加简洁、准确。

参考文献

　1 Huang ShiHe(黄仕和)， Xu SiHong(许四宏)， Li YunChun(李云春). Chemistry of Life(生命的化学)， 2001， 21(5)： 389～391

　　2 Blom T， Franzén A， Heinegrd D， Holmdahl R. Science， 2003， 299(21) : 1845～1846

　　3 Daria L， Patrizia D E， Helena S， Barbara S， Ann F C， Antonella N， Silvano S， Beatrice N， Domenico R， Marco P. J. Immunol.， 2003， 171: 1085～1093

　　4 Denhardt D T， Guo X J. FASEB， 1993， 7(12): 1475～1482

　　5 Stossel T P. Science， 1993， 260: 1086～1094

　　6 De Arruda. J. Cell Biol.， 1990， 111: 1069～1079

　　7 Ashkar S， Weber G F， Panoutsakopoulou V， Sanchirico M E， Jansson M， Zawaideh S， Rittling S R， Denhardt D T， Glimcher M J， Cantor H. Science， 2000， 287: 860～864

　　8 Hirama M， Takahashi F， Takahashi K， Akutagawa S， Soma S， Shimanuki Y， Nishio K， Fukuchi Y. Cancer Lett.， 2003， 198(1): 107～117

　　9 Fan Zhe(范 哲)， Li HongYan(李鸿雁)， Long Yi(龙 毅)， Liu Ya(刘 娅). Chinese Journal of Laboratory Diagnosis(中国实验诊断学)， 2005， 9(2)： 307～309

　　10 Chabas D， Baranzini S E， Mitchell D， Bernard C C A， Rittling S R， Denhardt D T， Sobel R A， Lock C， Karpuj M， Pedotti R， Heller R， Oksenberg J R. Steinman L. Science， 2001， 294: 1731～1735

　　11 Xu Rong(许 荣)， Zhong LiMin(钟丽民)， Yuan Bin(袁 斌). Chinese Journal of Rheumatology(中华风湿病学杂志)， 2006， 10(5)： 261～264

　　12 Zang JingWu(臧敬五). Achievement && Application(成果与应用)， 2005， 20(3)： 208～210

　　13 Comisarow M B， Marshall A G. Chemical Physics Letters.， 1974， 25: 282～283

　　14 Comisarow M B， Marshall A G. J. Mass Spectrom.， 1996， 31: 581～585

　　15 Xiong ShaoXiang(熊少祥)， Pu Dan(蒲 丹)， Xin Bin(辛 斌)， Wang GuangHui(王光辉). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2003， 31(4)： 429～434

　　16 Yang SongCheng(杨松成)， Wei KaiHua(魏开华)， Zhang XueMin(张学敏). Journal of Instrumental Analysis(分析测试学报)， 2005， 24(6)： 1～3

　　17 Zubarev R. Expert Rev. Proteomics， 2006， 3 (2): 251～261

　　18 Kjeldsen F， Savitski M M， Nielsen M L， Shi L， Zubarev R Z. Analyst.， 2007， 132: 768～776