毛细管电泳与芯片毛细管电泳的双检测技术

　　　　 作者：李想 童艳丽 刘 翠 李偶连 杨秀娟 陈缵光

【摘要】 综述了毛细管电泳和芯片毛细管电泳的3种双检测技术，包括荧光散射等光学双检测技术、安培非接触电导等电化学双检测技术和荧光非接触电导等光电联用双检测技术。介绍了3种双检测方法的仪器的检测原理及应用，并展望了双检测技术的发展前景。引用文献54篇。

【关键词】 毛细管电泳， 芯片毛细管电泳， 双检测， 评述

　　　　1 引 言

　　毛细管电泳(CE)以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力，根据组分的淌度和分配系数的差异进行分离。芯片毛细管电泳(Microchip capillary electrophoresis， MCE)自1992年由Manz首次报道[1]以来迅速发展，它将微流控芯片的集成化技术与CE的分离检测技术相结合，在石英、玻璃或塑料等基片上刻制微通道，实现样品的处理、分离及检测等，比CE分析速度更快。CE和MCE具有高效、快速、微量、经济、污染小和分析样品范围广等特点，现已应用于医学研究[2]、食品分析[3]、环境分析[4]、药物分析[5]、蛋白质分析[6]、手性分离[7]及单细胞分析[8]等领域中。

　　CE和MCE的分离通道内径狭小、分析速度快，要求检测器灵敏、快速、微型化和集成化，检测器成为了研究重点之一。在诸多检测技术中，紫外可见吸收[9，10]、荧光检测(Fluorescence detection， FD)[11，12]等光学检测技术应用较为普遍。电化学发光检测[13，14]、安培检测[15，16]、电位检测[17]、接触式电导检测[18]和非接触电导检测(Contactless conductivity detection， CCD)[19，20]等电化学检测技术以灵敏度高、选择性好、装置简单等优势受到重视。质谱(MS)自1987年首次报道用于CE检测[21]以来，在CE和MCE中已有应用，并随着接口技术[22]的发展，显示了它的发展潜力。此外还有拉曼光谱[23]、核磁共振[24]等多种新型检测技术，各自具有独特优势和适用范围。

　　虽然检测方法多样，但是单检测技术仍存在一定的局限性，在分析测定样品时，需要根据分析物的性质和检测灵敏度来选择合适的检测方法，如FD法只适用于测定具有荧光发色基团或经过衍生后具有荧光特性的物质;安培法适用于测定具有电化学活性的物质;而电导法擅长于测定荷电成分。当样品成分较复杂时，只使用单一检测法无法一次分析测定多种性质样品，而将两种或多种检测方法联用，可以发挥各自的优势，相互补充，能一次检测更多种类物质，避免了多次测定，降低分析成本。本文将目前的各种双检测技术分为光学双检测技术、电化学双检测技术和光电联用双检测技术，并分别介绍了这3种双检测技术的装置设计及应用。

　　2 光学双检测技术

　　2.1 双荧光束检测

　　FD是CE和MCE检测器中最灵敏的检测方法之一，检出限可达1×10-13～1×10-9 mol/L[25]。FD只适用于测定本身或衍生后产生荧光的物质，专属性较强，且要根据待测物或衍生试剂的荧光特性来选择相应的激发光源。测定复杂样品时，若待测物的激发波长不相近，用单一激发光源无法同时测定这些待测物。Masaki等[26]设计了MCE的双荧光束检测装置。分别使用波长为370 nm的发光二极管和395 nm的激光二极管作为激发光源，实现双荧光束检测。

　　2.2 FD光散射双检测

　　激光诱导荧光光散射双检测[27]采用了鞘流池结构的过柱检测方式，激光经过鞘流池后由光束分离器分为两部分，6%的反射光用于散射检测，94%的透射光用于FD，从而实现FD光散射双检测。装置已被用于监测荧光标记线粒体等亚微粒子。光散射可测定粒子大小及结构等特性，但其专属性较差。联合FD，利用荧光信号辨别待测粒子的光散射信号，排除其它粒子的干扰，提高了检测的专属性和准确性。

　　3 电化学双检测技术

　　光学检测法常因分离通道内径狭小受光程限制，而电化学检测受这种问题影响很小，且灵敏度高、选择性好、装置简单、成本低，用于CE和MCE中具有一定优势。目前已有多种复合式电化学双检测技术。

　　3.1 双电极安培检测

　　安培检测法只测定在电极上具有电化学活性的物质，选择性高、操作简便，检出限可达到1×10-10～1×10-7 mol/L[28]。自1987年由Wallingford等[29]将安培检测法应用于CE以来，得到了新的发展。其中工作电极对检测性能至关重要，目前有金属电极[30]、碳电极[31]和化学修饰电极[32]等几种，需要根据待测物的电化学活性和背景电流大小选择合适的电极。在测定复杂样品时，可采用双电极安培检测技术，在双电极上分别施加不同的电势进行测定，可提高选择性和灵敏度。目前已有多种构造及电极材料和不同检测方式的双电极检测技术用于分析测定。

　　3.1.1 微圆盘柱上金膜双电极安培检测 Chen等[33]设计了CE微圆盘柱上金薄膜双电极安培检测装置。将金蒸汽沉积在分离毛细管的末端内壁及出口横切面上，一根金线穿入一段相同外径的毛细管中制成微圆盘电极，对准固定两段毛细管，使横切面上的金薄膜电极部分与微圆盘电极构成薄层结构。分析物先在毛细管内壁的金薄膜电极上发生电化学反应，随后通过薄层结构时，具有可逆电化学反应特性的物质会发生氧化还原循环反应，使检测信号明显增强，提高了检测灵敏度。

　　3.1.2 双金属电极安培检测 Martin等[34]设计了MCE双金属电极安培检测装置。该装置在分离通道出口约15 μm附近并列放置4个相距约40 μm的金属电极，向接近通道出口的两个工作电极提供不同的电势，分别测定氧化电流和还原电流，形成的两个谱图相互补充，并可根据分析物的电化学可逆性确证各谱图中的化合物峰，从而提高安培检测的选择性和分析物定性的可靠性。另外两个工作电极作为候补，避免前两个电极损坏后更换电极板，减小仪器系统误差。

　　3.1.3 其它双电极安培检测装置 Gawron等[35]用MCE双碳纤维电极安培检测器测定了多肽Cu(Ⅱ)络合物，两个电极分别用于检测络合物的氧化反应和还原反应产生的信号。该双碳纤维电极不存在金属电极边缘离子扩散的问题，使用寿命更长，且灵敏度较高，对儿茶酚的检出限达到500 nmol/L，比MCE双金属电极的测定值[34]低一个数量级。他们还采用不同的电极材料和电极放置形式来解决CE和MCE通道狭小给电极放置带来的困难，改进了双电极安培检测的装置结构、扩宽了分析应用范围。他们设计的CE环盘双电极和平行双电极[36]，先用化学蒸汽沉积法在碳纤维表面依次沉积硅层和热解石墨层，制成内盘外环的双电极，然后将其穿入一根毛细管内，并暴露末端制成圆锥形尖端用作检测。由于热解石墨比碳纤维化学活性低，且双电极表面积较小，造成电流响应小，分离电压干扰大，故其灵敏度不如双碳纤维电极高，但该双电极更换电极更方便，且可以选择柱端检测方式或将电极伸入分离毛细管内实现柱内检测。平行双电极是将两个碳纤维平行放置于一根毛细管末端，并用Nafion接口连接分离毛细管。平行双电极可以同时测定氧化活性物质和还原活性物质。1998年，他们设计了双铂线电极[37]。将一根铂丝穿入分离毛细管中，另一根弯曲固定在分离毛细管出口外。该电极被永久固定，不需要像CE环盘双电极那样进行复杂的毛细管和电极的调准较直。他们制作了管线双电极[38]，将管状金电极固定在分离毛细管出口外壁上，并将一根金线穿入毛细管中制成线电极，将其伸入管电极内，减小了两个电极间距离，从而减小检测死体积和峰展宽，但距离过小会使背景干扰增大。他们还将热解光刻胶作为电极材料用于MCE双电极安培检测[39]。

　　3.2 安培CCD双检测

　　安培检测法虽然灵敏度较高，但只能测定电化学活性物质，测定范围窄。而电导检测法是一种较通用的检测器，可通过选择合适的条件测定所有离子型组分，检出限可达到1× 10-8～1×10-6 mol/L[40]。其中，CCD相对接触式电导检测法来说，减小甚至消除了电极污染、背景噪音较小。将CCD和安培检测结合，可以发挥CCD通用性强、安培检测高选择性和高灵敏度的优势，相互补充。Wang等[41]将两个铝铂分别固定在分离通道两侧作为CCD电极，并将电极末端扩宽至4 mm以便与电路连接。两个电极间距为1.3 mm，按照逆平行的方向放置以减小电极间杂散电容。安培检测采用柱端检测方式，将分离通道的检测池去掉，在通道出口直接放置厚膜碳电极。两种方法联用扩大了检测对象范围，两种检测互不干扰，分别提供同一种化合物的不同信息，进一步确认化合物峰，提高重现性。

　　3.3 安培电化学发光双检测

　　上述安培CCD双检测虽然有利于确证化合物峰，但是两者分别采用柱端和柱上检测方式，有效分离长度不同，检测时间存在差距，不能同时同点检测。Qiu等[42]设计的安培电化学发光双检测装置用一根工作电极同时进行两种检测，检测信号同时产生，能更准确的确证峰，且装置组装更简单。该双检测系统使用三联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)作为化学发光试剂和电化学反应催化剂。供给工作电极一定电势后，Ru(bpy)2+3被电极氧化成Ru(bpy)3+3， Ru(bpy)3+3与分析物反应产生化学发光的同时催化电化学反应发生，从而实现安培电化学双检测。

　　4 光电联用双检测技术

　　4.1 FD安培双检测

　　FD和安培检测均是专属性强、灵敏度高的检测方法。Lapos等[43]在MCE上将两种方法联用，同时测定电活性化合物多巴胺、儿茶酚和荧光标记的精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸。FD和安培检测分别采用在柱和离柱检测方式，两种检测不在同一时间发生，同一物质在两个谱图上出峰时间不一致。

　　4.2 FDCCD双检测

　　用FD法进行测定时，当分析物中含有无荧光特性的离子物质时，可以联用CCD法，两者相互补充，发挥各自优势，降低分析物的检出限。并且现有的FDCCD双检测装置均利用两个CCD电极之间的位置作为荧光检测窗，使两种检测同时同点进行。相比FD安培双检测法，谱峰确证的优势更佳。

　　Tan等[44]将两根不锈钢管距离2 mm套在毛细管外面，作为CCD检测电极，并用一接地铜片在两个电极间屏蔽耦合电容，以蓝光发光二极管作为荧光激发光源，发射光通过光纤传出，经滤光片滤光后荧光由光电倍增管接收。本课题组[45]研制的MCEFDCCD双检测装置不使用光纤而直接以光电二极管作为接收元件，缩短了发射光的光程，减小衰减，提高灵敏度。但同时存在受杂散光干扰较大的不足，可以使用滤波片来减小干扰、降低噪音。FDCCD双检测装置均采用发光二极管作为荧光激发光源，相对FD安培双检测装置的氩离子激光器而言，发光二极管成本低、体积小、能量消耗小、寿命长、可选波长多[46]。其体积小更有利于在CCD检测电极间进行荧光检测，有助于实现同时进行双检测，但其激发光强度低于激光器。

　　4.3 UV安培双检测

　　FD法虽然灵敏度高，但只适用于有荧光的物质，而衍生反应则复杂费时、对测定干扰大，使得FD在实际应用中受到一定的限制。相比而言，UV法是一种通用检测方法，测定范围广。但UV法受到毛细管内径的限制，光程短、检测灵敏度不高，可以联用其它检测方法，相互补充，达到更灵敏地测定多种化合物的目的。Huang等[47]建立了在柱UV和离柱安培相结合的双检测装置。安培检测用Nafion管接口分离毛细管和检测电极，并利用螺丝固定的两个玻璃体来组装各检测元件，故可以方便的安装、拆卸电极和毛细管;调整电极和接口的位置，且可用不同外径的毛细管。

　　4.4 UVCCD双检测

　　小分子的无机离子无法用UV法进行测定，但非常适合于CCD检定.两种方法联用，可以同时测定无机离子和有机物质，提高分析效率，扩大应用范围。这种双检测方法不仅用于物质的定量分析，还应用于化学常数的测定。

　　Chvojka等[48]设计了CEUVCCD双检测装置，将两根细铜线分别绕在毛细管上，构成两个间距为2 mm的管状电极，该电极距离决定了光学检测窗的大小。UV检测通过垂直于毛细管放置的两根光纤来输入及输出光信号。该装置更换毛细管时需拆除检测器，重新组装比较复杂费时，且增大分析的系统误差。因此，Novotn等[49]改进了UVCCD双检测装置，用铝铂制成两个半管状电极，距离2 mm固定在树脂玻璃板的半管状凹槽内。入射光由穿过树脂玻璃板至两个电极中间的光纤传入，透射光通过小孔后由光电二极管直接接收。该装置的毛细管、电极和光纤通过两块玻璃板固定，可以方便更换毛细管，不需要重新装配检测原件，重现性更好。

　　Jensen等[50]设计的UVCCD双检测装置使用不锈钢注射器针头套在毛细管外作为CCD电极，电极更换更容易。然而该装置的UV检测窗和CCD检测电极位于毛细管的不同位置，双检测不在同点同时进行。Henchoz等[51]用CEUVCCD双检测法测定了20种氨基酸的解离常数。另外，也有将CEUVCCD双检测装置应用于不同物质的分析测定中的报道[52～54]。

　　以上介绍了各双检测技术的装置结构和特点，可将其分为序列双检测和平行双检测两种。序列双检测的各检测单元位于分离通道不同位置，分析物先后通过两个检测单元，因此在两个谱图上出峰时间存在差异。而平行双检测的两种检测处于同一位置，能够对分离物质同时测定，谱图中出峰时间相同，相比序列双检测来说，更有利于样品峰的确证。双检测技术的应用列于表1。表1 双检测技术的应用

　　5 总结与展望

　　CE和MCE作为高效快速的分离分析方法，要求检测器灵敏度高、响应快速，因此检测器的发展对CE和MCE至关重要。与单检测技术相比，双检测技术具有省时、高效等优势，可以充分发挥联用检测器的各自优势，相互补充，扩大检测范围，实现更多分析物的同时分离和检测。不同检测器可以分别提供相关化合物的不同信息，提高确证化合物色谱峰的准确性及分离检测的选择性、重现性和灵敏度。因此，发展双检测技术是改进CE和MCE检测器水平的重要手段。

　　由于双检测技术尚处于早期发展阶段，双检测的联用模式还较少，且各种双检测技术的应用领域有待拓宽。随着各项检测技术的发展进步，以及新型检测器的研制成功，期望双检测装置更加完善，开发新型的双检测装置，并能更广泛地应用到食品药品分析、环境分析、医学研究等众多领域中。

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